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ショウジョウバエ初期胚からの細胞粗抽出液中に、紫外線照射されたDNAに特異的に結合する蛋白が少なくとも2種類存在することをゲル・シフト・アッセイ法により示す事に成功し、昨年度の本報告書により報告した。今年度は、この蛋白因子の単離・精製を試みた。単離・精製にはヘパリン・アガロ-スゲルおよび紫外線照射DNAセファロ-スゲルの2種のアフィニティゲルによるカラムクロマトグラフィを用いた。
紫外線照射DNA結合因子として2種類(Factor1およびFactor2)を同定している。細胞粗抽出液をヘパリンアガロ-スゲルに吸着後塩濃度を上げていき溶出させたところ、Factor1は、約400mM NaClで、Factor2は、約550mM NaClで溶出する事が解った。各々の活性を含む分画は紫外線照射DNAセファロ-スゲルを用い更に精製を行った。紫外線照射DNAセファロ-スゲルは、サケ精子DNAを機械的におよび制限酵素を用いて約1Kbの断片にした後、紫外線照射したものをCNBr活性化セファロ-スゲルに結合させる事により作成した。ヘパリンアガロ-ス分画を紫外線照射DNAアフィニティカラムに吸着させた後塩濃度を上げていき溶出させたところ、Factor1は、約400mM NaClで溶出してきたが、Factor2は、1Mまで塩濃度を上昇させても溶出してこなかった。光回復酵素による影響を除外するため全操作は黄色燈の下で行っているが、ここで蛍光燈の光をカラムに照射しながら1Mの塩を含むバッファ-で洗ったところFactor2が溶出してくる事が解った。蛋白因子の回収率をゲルシフト法のバンドの強さから類推すると、いずれも50〜70%の高率であった。そこで全体をスケ-ルアップし、約30gの胚より出発し、Factor2については、約5μgの蛋白を得る事に成功した。Factor1については、未だ完全に単離する事には成功しておらず、今後の課題である。
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