カルモデュリン依存性プロティンキナ-ゼIIの活性発現の調節

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01638519
• 研究機関: (財)東京都神経科学総合研究所
• 研究代表者: 山内 卓 (財)東京都神経科学総合研究所, 神経生化学研究室, 副参事研究員 (90041813)
• 研究分担者: 関原 俊一 東京都神経科学総合研究所, 研究員 (40206636)
• キーワード: cDNAの発現 / カルモデュリン、Ca^<2+> / 蛋白質リン酸化 / 部位特異的変異cDNA / 欠失cDNA

研究概要

ラット脳のカルモデュリン依存性プロティンキナ-ゼII(キナ-ゼII)のαとβサブユニットのcDNAを調製し、発現ベクタ-に組込みα-cDNA,β-cDNAを単独あるいは両者同時にCHO細胞やCOS細胞に導入し、発現させることに成功した。また、α-cDNAの部位特異的変異法や欠失法による変異cDNAを構築し、発現ベクタ-に組込み、培養細胞に発現させることにも成功し、それぞれの酵素の性質を調べ以下のことが明らかとなった。(1)αおよびβサブユニット単独でも活性を示す。(2)αとβサブユニットの酵素学的性質は類似しているが、カルモデュリンに対する親和性などいくつかの相違点が見出された。(3)αサブユニット単独でも重合し、脳のキナ-ゼIIと同様の分子量を示すが、βサブユニット単独では重合しない。(4)両サブユニットとも単独で自己リン酸化される。自己リン酸化によりCa^<2+>非依存性活性が現われる。(5)αとβサブユニットは共に三つの構成部位、触媒部位、制御部位、含合部位から構成されているが、欠失cDNAの発現により、C末端部分の含合部位がサブユニットの含合と自己リン酸化による酵素活性の調節に重要である。(6)部位特異的変異法によりαサブユニットの変異cDNAを構築し、発現させて、酵素の活性を調べると、Thr286は、自己リン酸化されることにより、Ca^<2+>非依存性活性の出現に必須であること。
このように、cDNAを動物培養細胞で発現させることにより、脳の構造を使用していただけでは解析できないような、αとβサブユニットの基本的な性質と構造機能の関係を明らかにすることができた。また、部位特異的変異法により、特定のアミノ酸残基(Thr286)が酵素の活性調節に重要であることが明らかとなった。今後は、神経細胞を発現させることにより、神経情報伝達におけるキナ-ゼIIの生理的役割をさらに追求する。

研究成果

• [文献書誌] Yamauchi,T.,Ohsako,S.Deguchi,T.: "Expression and characterization of calmodulin-dependent protein Kinase II from cloned cDNAs in Chinese hamster ovary cells" J.Biol.Chem.264. 19108-19116 (1989)
• [文献書誌] Imai,Y.,Yamauchi,T.,Fujiawa,H.: "Modulation of Tryptophem Hydroxylase Activity by Phospholipids:Stimulation Followed by Inactivation" J.Neurochem. 53. 1293-1299 (1989)
• [文献書誌] Ohsako,S.,Nakazawa,H.,Sekihara,S.,Ikai,A.,Yamauchi,T.: "Role of Thr-286 as Autcphosphorylation site for Appearance of Ca^<2+>-Independent Activity Calmodulin dependent protein Kinase II α Subunit" Biochim.Biophys.Acta.
• [文献書誌] Yamauchi,T.,Sekihara,S.,Ohsako,S.: "Subcellular distribution of α and β subunit proteins of calmodulin-dependent protein Kinase II expressed in Chinese hamster ovary cells" Biochem.Biophys.Res.Commun.
• [文献書誌] 山内卓(分担)佐藤昌康編: "ブレインサイエンスII" 朝倉書店, 49-60 (1989)