G蛋白質と連関した神経伝達物質受容体の精製法の開発

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01870003
• 研究種目: 試験研究(B)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 芳賀 達也 東京大学, 医学部, 教授 (30011646)
• 研究分担者: 野田 康二 旭化成, 開発室, 室長 ; 石田 寅夫 旭化成, ライフサイエンス研究所, 所長
• キーワード: G蛋白質 / アセチルコリン受容体 / ムスカリン受容体 / 蛋白質精製法 / アフィニティ-クロマトグラフィ- / レセプタ- / GTP結合蛋白質 / バキュロウイルス

研究概要

(1)ムスカリン受容体を比較的多量に調製する為、ムスカリン受容体のcDNAをバキュロウイルスに組込み昆虫培養細胞(Sf9)で発現させる系を導入した。11の培養液あたり、m2とm3サブタイプで約10nmol、ml、m4で数nmolの受容体が得られるようになった。(2)バキュロウイルス・昆虫細胞系で発現させたm2サブタイプは、大脳あるいは心房標品と同等以上の効率で可溶化・精製され、リン脂質中の再構成系でG蛋白質と相互作用した。(3)リン脂質中で受容体とG蛋白質の複合体を生成させる最適な条件を検討した結果、ムスカリン受容体・G蛋白質複合体には2種類あることが推測された。Mgが存在するときの複合体はアゴニストにより高親和性で、アゴニスト存在時にGDPに低親和性を示した。(4)ムスカリン受容体とG蛋白質をリン脂質に再構成させた系から受容体・G蛋白質複合体を可溶化する条件を、種々の界面性剤を用いて検討した。その結果、庶糖脂肪酸エステルを含む低イオン強度溶液による可溶化標品でグアニンヌクレオチド依存性高親和性結合が観察された。複合体可溶化の収率を上げ、可溶化複合体を安定に保つ条件を検討している。(5)アゴニスト・受容体・G蛋白質複合体の存在を証明するため、受容体のレクチン(Wheat Germ Hemaggulutinin)への結合条件の検討を開始した。(6)G蛋白質βγサブユニットを比較的多量調製し、単クロ-ン抗体調製の試みを継続している。(7)G蛋白質βγサブユニットをアガロ-スゲルに架橋した標品の調製を試みている。そこにG蛋白質αサブユニット及び受容体を結合させる実験を行なう予定である。

研究成果

• [文献書誌] K.Ohara: "Interaction of deglycosylated muscarinic receptors with ligands and G proteins." Eur.J.Pharmacol.189. 341-346 (1990)
• [文献書誌] T.Haga: "The interaction of acetylcholine receptors in porcine atrial membrances with three kinds of G proteins." Jap.Circulation J.54. 1176-1184 (1990)
• [文献書誌] H.Uchiyama: "Location in muscarinic acetylcholine receptors of sites for [^3H]propylbenzylcholine mustard binding and for phosphorylation with protein kinase C." J.Neurochem. 54. 1870-1881 (1990)
• [文献書誌] K.Haga: "Dual regulation by G proteins of agonistーdependent phosphorylation of muscarinic acetylcholine receptors." FEBS Lett.268. 43-47 (1990)
• [文献書誌] T.Haga: "Reconstitution of muscarinic acetylcholine receptors and G proteins.In “ReceptorーEffector Coupling:A practical approach",ed.by E.C.Hulme." Oxford University Press,Oxford, 16 (1990)
• [文献書誌] G.Berstein: "Molecular aspects of muscarinic receptors.In“Current aspects in the Neurosciences,Vol.1",ed.by N.Osborne" Macmillam Press,London., 40 (1990)