好熱菌の熱ショックタンパク質によるタンパク質の再活性化と膜輸送

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01870015
• 研究種目: 試験研究
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 香川 靖雄 自治医科大学, 医学部, 教授 (30048962)
• 研究分担者: 浜本 敏郎 自治医科大学, 医学部, 講師 (30189625) ; 太田 成男 自治医科大学, 医学部, 講師 (00125832) ; 平田 肇 自治医科大学, 医学部, 講師 (40049052) ; 曽根 のぶ史 自治医科大学, 医学部, 助教授 (20049034)
• キーワード: 熱ショックタンパク質 / 好熱菌hsp / 高次構造再構成 / シャペロニン / 安定hsp

研究概要

[目的]大部分の蛋白質は一度変性されると活性の再現は不可能である。ところが、熱ショック蛋白質(hsp)の中でもシャペロニンと呼ばれる一群の蛋白質を加えると、活性を持った高次構造が形成されることが遺伝学的にも、またガラス器内でも成功した。ところが常温菌のhsp60は14量体を構成しており不安定である。好熱菌の蛋白質はすべて安定であるから好熱菌に熱ショック蛋白質があればきわめて有用である活性を持つ高次構造の人為的形成も可能となる。
[結果]本試験研究によって初めて好熱菌にも各種の熱ショック蛋白質が存在することが証明された。好熱菌PS3の上清をATPアガロ-スカラムによるアフィニティ-クロマトグラフィ-で部分精製したタンパク質はATP存在下で変性酵素を再活性化した。そこでヒドロキシアパタイト、Qカラム、逆相カラム等を利用して常温生物のhsp70,hsp60,hsp10の各々に相同性の蛋白質として69K,61K,12Kの好熱性hspの3種をSDSゲル電気泳動で単一のバンドにまで精製した。そしてその3種の好熱性hspのアミノ酸配列はそれぞれに対応する常温生物のhspときわめて高い相同性をしめした。熱ショック蛋白質(hsp)は細胞が亜致死的な熱を受けた際に一時的に発現されるが本試験研究では好熱菌PS3に60℃から72℃まで培地温度を上げて熱ショックをあたえてELISA法を用いてhsp61の形成を見たところ、僅か10分間にその量が全上清タンパク質の1.5%から3%へと増加した。
[成果の発表と特許の申請]本研究の成果は既に特許として出願中であり、またhspの国際学会や日本生化学会で発表された。実用化にはhspの固定化などを行って回収すること、何等かの工業化ではATPをADPからアセチルリン酸とアセチルキナ-ゼで再生する系も必要となろう。

研究成果

• [文献書誌] Muneyuki,E.,Kagawa,Y.and Hirata,H.: "Steady state Kinetics of proton translocation catalyzed by thermophilic F_0F_l ATPase reconstituted in planar bilayer membranes." J.Biol.Chem.264. 6092-6096 (1989)
• [文献書誌] Kagawa,Y.,Ohta,s.and Otawara-Hamamoto,Y.: "Alpha 3 beta 3 complex of thermophilic ATP synthase Catalysis without the gamma-subunit." FEBS Letters. 249. 67-69 (1989)
• [文献書誌] Yoshimura,H.,Endo,S.,Matsumoto,M.,Nagayama,K.and Kagawa Y.: "Hexagonal structure of two-dimensional crystals of the alpha 3 beta 3 complex of thermophilic ATP synthase." J.Biochem.106. 958-960 (1989)
• [文献書誌] Endo,H.,Hasegawa,K.Narisawa,K.,Tada,K.Kagawa,Y.and Ohta,S.: "Defective gene in lactic acidodis:Abnormal pyruvate Dehydrogenase E_1 a-subunit caused by a frame shift." Am.J.Human Genetics. 44. 358-364 (1989)
• [文献書誌] Tomura,H.,Endo,H.,Kagawa,Y.and Ohta,S.: "Novel regulatory enhancer in the nuclear gene of the human mitochondrial ATP synthase beta-subunit." J.Biol.Chem.265. (1990)
• [文献書誌] Ito,Y.,Harada,M.,Ohta,S.,Kagawa,Y.,Aono,O.,Schefer,J.et al: "Small-angle neutron scattering studies of the reconstituted TF_1 from thermophilic bacterium with deuterated subunits." J.Molecular Biol.(1990)
• [文献書誌] 香川靖雄: "岩波講座・分子生物科学第7巻エネルギ-の生産と運動" 岩波書店,
• [文献書誌] Kagawa,Y.,Ohta,S.,Hirata,H.,Hamamoto,T.and Karube,I.: "Stable oligomeric proteins for biosensors:Protein chemistry,gene engineering and electronics." Springer-Verlag,Berlin., (1990)