好熱菌の熱ショックタンパク質によるタンパク質の再活性化と膜輸送

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01870015
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 香川 靖雄 自治医科大学, 医学部, 教授 (30048962)
• 研究分担者: 中西 真 自治医科大学, 医学部, 助手 (40217774) ; 太田 成男 自治医科大学, 医学部, 助教授 (00125832) ; 浜本 敏郎 自治医科大学, 医学部, 講師 (30189625)
• キーワード: heat shock protein / thermophilic chaperonin / reconstitution / ATP synthase / thermophilic gene / hsp gene / oligomer / synchrotron radiation

研究概要

生体内の各種の超高分子構造を人工的に形成する技術は生物の諸活性の再現に不可欠である。そこで細胞内で構造形成と変性後の構造復元を促進している熱ショックタンパク質のシャペロニン群の使用を試みた。この目的のために、タンパク質の安定な好熱菌よりこれらのタンパク質としてhsp61,hsp12を精製し、その遺伝子や機能を研究し、さらにhsp69も精製した。好熱菌と常温菌の対応タンパク質の構造を比較するとhsp61はrefoldase(GroEL)、hsp12はGroES、hsp69はunfoldaseにそれぞれ相同であった。これらのアミノ酸配列に対応するDNA探索子を合成し、hsp61とhsp12の遺伝子を決定したところ両者はオペロンを形成していた.熱ショックタンパク質に対する抗体を用いてELISAで定量しhsp60は好熱菌上清総タンパク質量の1-3%を占め,好熱菌であるにもかかわらず熱ショック応答が見られた.さらにhsp60はATP合成酵素のαサブユニットとも相同性を示す。αサブユニットも分子量、ATP結合能が似ており、熱ショックタンパク質であるだけでなく、アフリカツメガエルの受精卵の動物極に極めて多く形態形成に関与していると推定されている。そこで好熱菌のαサブユニットの精製、遺伝子構造の決定、大量発現法をも完成した。好熱菌のαサブユニットも安定で極めて再構成能に富み、従来不可能とされた活性あるサブユニット複合体類α1β1およびα3β3の再構成が可能となった.このことは既に膜輸送のエネルギ-供給系としてのATP合成酵素の構造と機能の解明に大きな進歩となった。これら複合体の再活性化と会合の過程は始めはX線小角散乱と冷中性子小角散乱法を用いて解析されていたが、シンクロトロン放射光による高い時間分解能を利用して分析され、そのエネルギ-変換過程が明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Tamada,H.,Ohta,T.,Hamamoto,T.,Otawara-Hamamoto,Y.,Yanagi,M.,Kagawa,Y.: "Gene structure of heat shock proteins 61KDa and 12KDa (thermphilic chaperonins) of thermophilic bacterium PS3." Biochem.Biophys.Res.Commun.179. 565-571 (1991)
• [文献書誌] Aloise,P.,Kagawa,Y.and Coleman,P.S.: "Comparative Mg^<2+>-dependent sequential covalent binding stoichiometry of 3'-0-(4-benzoyl) benzoyl adenosine 5'-diphosphate of MF1,TF1,and alpha3-beta3 core complex of TF1." J.Biol.Chem.266. 10368-10376 (1991)
• [文献書誌] Harada,M.,Ito,Y.,Sato,M.Aono,O.,Ohta,S.and Kagawa,Y.: "Small-angle X-ray scattering studies of Mg・AT(D)P-induced hexamer to dimer dissociation in the reconstituted alpha3 beta3 complex of ATP synthase from thermophilic bacterium PS3." J.Biol.Chem.266. 11455-11460 (1991)
• [文献書誌] Shirakibara,Y.,Yohda,M.,Kagawa,Y.,Yokoyama,K.and Yoshida,M.: "Purification by dye-ligand chromatography and crystallization study of the F_1-ATPase and its major subunits alpha and beta,from a thermophilic bacterium PS3." J.Biochem.109. 466-477 (1991)
• [文献書誌] 香川 靖雄、玉田 寛、太田 敏子、浜本 敏郎: "好熱菌シャペロニンとATP合成酵素。" Cell Science. 7. 711-717 (1991)
• [文献書誌] 香川 靖雄、太田 成男、浜本 敏郎: "エネルギ-産生膜の形成と機能:シャペロニン類と遺伝子の役割。" 膜. 16. 212-222 (1991)
• [文献書誌] Kagawa,Y.: "Biocomputers--The Next Generation from Japan. Bioenergetics and biodevices" Chapman and Hall,New York,Translator:Norman,K., 375 (1991)
• [文献書誌] Kagawa,Y.,Ohta,S.,Hamamoto,T.,Harada,M Ito,Y.and Sato,M.: "New Era of Bioenergetics. The alphal betal heterodimer and molecular assembly of ATP synthase" Academic Press,New York,(Mukohata,Y.ed.), 560 (1991)