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1991 年度 研究成果報告書概要

歯科材料の簡易・高感受性細胞毒性試験法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 01870080
研究種目

試験研究(B)

配分区分補助金
研究分野 補綴理工系歯学
研究機関東京医科歯科大学

研究代表者

佐藤 温重  東京医科歯科大学, 歯学部, 教授 (40045985)

研究分担者 本郷 敏雄  東京医科歯科大学, 歯学部, 助手 (60142444)
佐藤 和子  東京医科歯科大学, 歯学部, 助手 (50046083)
研究期間 (年度) 1989 – 1991
キーワード細胞毒性試験法 / SV-40largeT遺伝子導入による不死化 / ヒト歯髄由来細胞 / マウス頭頂骨由来細胞 / 骨芽細胞 / ニュートラルレッドアッセイ / MTTアッセイ / 細胞内カルシウムイオン量
研究概要

歯科材料の為害性を適確に簡易に高感度に予知できる細胞毒性試験法を開発するために、1)臓器特性を有する試験細胞を開発し、2)試験法の検出力、簡便性の検討、3)高感度毒性指標について検討を行った。
1.試験細胞の開発:(1)ヒト抜去歯から分離した歯髄細胞を培養しSV40large Tとgeneticin耐性遺伝子PSV1-neoからなるプラスミドpMT1-neoをリン酸カルシウム共沈法で導入して多数のコロニーを分離し、それらの中から増殖性が高く、アルカリ性ホスファターゼ(ALPase)活性の高いコロニーを選択して100代以上の継代を続け、歯髄由来樹立細胞株を得てLSC細胞と命名した。LSC細胞は骨/肝/腎型ALPaseを歯髄組織と同程度保有し、その活性は1α、25(OH)_2D_3等の添加により促進された。またビタミンC存在下でコラーゲン合成能を示した。(2)マウス頭頂骨から単離した細胞を培養し、1週間後に(1)と同様にpMT1-neoを導入し、ALPase活性の高いコロニーを60-100代の継代培養を続け樹立細胞株3種を得、DMCs,LMCs,VMCs細胞と命名した。これらの細胞は1)マウス腹腔内に8週間理殖したディフュージョンチャンバー内で石灰化骨基質を形成し、2)ノーザンブロッティング法によりI型コラーゲン、オステオポンチン遺伝子(mRNA)の発現を認めた。
2.毒性試験法について、本研究で開発したLSC細胞とHeLa、L細胞を用いてニュートラルレッド法(NR法)、MTT法、寒天重層法、ミリポアフィルター法の4法を比較検討した。塩化ニッケルの細胞毒性の検出力は、NR法=MTT法>>寒天重層法の順であり、試験法の簡便性はMTT法及びNR法が優れていた。毒性試験の再現性はMTT法の方がNR法に比較してやや良好であった。試験細胞の感受性はL=HeLa>LSCの順であった。
3.毒性指標として細胞内Caイオン量[Ca^<2+>]iについて検討した。Fura-2AMを負荷した腎尿細管由来JTC-12細胞において6.25μM以上のHgC1_2により、[Ca^<2+>]iは投与5秒後より用量依存性の(非可逆的)上昇が認められた。[Ca^<2+>]iは、高感度毒性指標となりうることが判明した。

  • 研究成果

    (20件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (20件)

  • [文献書誌] RIKITAKE,Y.: "A newly established cell line derived from the human dental pulp." Proc.Japan Acad.65B(8). 187-190 (1989)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] 力武 康次: "ヒト歯髄由来美容細胞のプラスミドpMT1-neo遺伝子導入による不死化について" 口病誌. 56(4). 540-560 (1989)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] 森末 裕行: "細胞培養法を応用した重金属の臓器毒性に関する基礎的研究" 口病誌. 56(2). 244-262 (1989)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] SATO,A.: "Mutagenicity of dental nickel-chromium alloys." Dentistry in Japan. 28. 129-135 (1991)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] 佐藤 温重: "バイオマテリアルのin vitro毒性試験の実情" J.Toxicol.Sci.15(3). 179 (1990)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] 佐藤 温重: "歯科材料の簡易・高感受細胞毒性試験法の開発" 歯科材料・器械. 9(16). 110 (1990)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] 五十嵐 良明: "細胞毒性試験の標準化-標準試料の作成とそれを用いた各種試験法の比較" 第12回日本バイオマテリアル学会大学 予稿集. 61 (1990)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] SATO,A.: "Studies on the standardization of cytotoxicity testing for dental materials." Tissue Culture in Dent.27. 33-35 (1990)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] SATO,A.: "Intracellular[Ca^<2+>]and cellular injury by nephrotoxic chemicals in renal cell cultures." Japan.J.Pharm.55Suppl.47P (1991)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] SATO,A.: "Toxicity tests of biomaterials in japan." In Vitro. 27. 172A (1991)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [文献書誌] RIKITAKE,Y.: "A Newly established cell line derived from the human dental pulp" Proc.Japan Acad.65B(8). 187 (1989)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] RIKITAKE,Y.: "Immortalization of human dental pulp cells with transfecting of the plasmid pMT1-neo" J.Stomatol.Soc.Jpn.56(2). 540 (1989)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] MORISUE,H.: "Application of renal epithelial cell culture in study of organ toxicity of heavy metals" J.Stomatol.Soc.Jpn.56(2). 244 (1989)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] SATO,A.: "Mutagenicity of dental nickel-chromium alloys" Dent. in Japan. 28. 129 (1991)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] SATO,A.: "In vitro toxicity tests of biomaterials" J.Toxicol.Sci.15(3). 179 (1990)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] SATO,A.: "A new in vitro cytotoxicity test method for dental materials" J.J.Dent.Mat.9(Suppl.). 110 (1990)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] IKARASHI,Y.: "Standardization for cytotoxicity test:Preparation of reference standard materials and comparison of the results using various test methodologies." Proc.the 12th Ann. Meet.Jap.Soc. for Biomater.61. (1990)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] SATO,A.: "Studies on the standardization of cytotoxicity testing for dental materials." Tissue Culture in Dent.27. 33 (1990)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] SATO,A.: "Intracellular[Ca^<2+>] and cellular injury by nephrotoxic chemicals in renal cell cultures." Japan.J.Pharm.55(Suppl.1). 47 (1991)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
  • [文献書誌] SATO,A.: "Toxicity tests of biomaterials in Japan." In vitro. 27. 172A (1991)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より

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公開日: 1994-03-18  

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