| 研究課題/領域番号 |
01870103
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
竹内 利行 群馬大学, 内分泌研究所・化学構造部門, 教授 (00109977)
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| 研究分担者 |
石川 英一 群馬大学, 医学部・皮膚科, 教授 (70008233)
小暮 公孝 群馬大学, 医学部・第一外科, 講師 (80143220)
堀内 龍也 群馬大学, 内分泌研究所・薬学部門, 助教授 (90008342)
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| キーワード | インスリン / 成長ホルモン / 遺伝子治療 |
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| 研究概要 |
インスリンなど多くの生理活性ペプチドは内分泌細胞で前駆体として産生され、分泌経路を通過する過程で、そのペプチドに隣接する塩基性アミノ酸対が蛋白分解酵素で切断をうけ、生理活性ペプチドとなる。他方、成長ホルモンやプロラクチンのように、粗面小胞体でシグナルペプチド部分が切断されるだけで生理活性ペプチドとなるものもある。生理活性ペプチド形成過程で、ペプチド前駆体が切断やペプチドカルボキシル端のアミド化をうけることをプロセッシングと言うが、これは神経内分泌細胞に特徴的で、皮膚細胞や線維芽細胞のような非内分泌細胞ではおこらないと考えられている。ところが我々は、このような非内分泌細胞でも、特有の塩基性アミノ酸配列を認識して切断する機構があることを見いだした。そこで、この切断機構に適合するように、ラットインスリン遺伝子に点変異を加えることにより、対応アミノ酸配列、B鎖ーArgーArgーCペプチドーLysーArgーA鎖を、B鎖ーArgーArgーLysーArgーCペプチドーArgーArgーLysーArgーA鎖となるようにした。この変異インスリン遺伝子を重金属で制御できるメタロサイオニンプロモ-タ-下に組み込んだところ、皮膚細胞や他の非内分泌細胞(NIH3T3,Ltk^-)では十分なペプチド発現を得ることができなかった。そこでSV40とレトロウイルスのプロモ-タ-を組み合わせた強力なプロモ-タ-SRαの下に変異インスリンを組み込み、同様の実験を行ったところ、大量のインスリンの発現を観察できた。現在、培養液と細胞中のインスリンを抽出し、非内分泌細胞でもインスリン前駆体が正常サイズのインスリンに変換されるかどうか、ゲル濾過やウエスタンブロッティング法を用いて検討している。成長ホルモン遺伝子も同様に、SRαプロモ-タ-下に組み入れて、メタロサイオニンプロモ-タ-下で発現させた場合とで発現効率の検討を開始した。
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