時間分解法と新しい蛍光試薬に基づく超高感度蛍光顕微鏡の開発と応用

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01880030
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 楠見 明弘 東京大学, 教養学部, 助教授 (50169992)
• 研究分担者: 内藤 正幸 オリンパス, 機器グループ, 主任研究員 ; 辻 明彦 浜松ホトニクス, 研究部, 研究員 ; 馬渕 一誠 東京大学, 教養学部, 教授 (40012520) ; 山口 和夫 神奈川大学, 理学部, 助教授 (20114902)
• キーワード: 蛍光顕微鏡 / 蛍光寿命 / 画像処理 / 共鳴エネルギ-移動 / エンドソ-ム / エンドサイト-シス / 膜融合

研究概要

時間分解顕微蛍光顕微鏡は、励起レ-ザ-光照射からゲ-トを開けるまでの遅延時間を任意に変化させることができる。そこで、同一視野でこの遅延時間を変化させて数枚の画像を撮り、画像処理計算することにより、顕微鏡の視野内の各点で蛍光寿命を同時測定し(空間分解能0.2μm)、寿命の大小をコントラストとする画像を得ることができる(蛍光命イメ-ジング法、Fluorescence Lifetime Imaging, FLIM)。
本年度はこのFILMの生体膜研究への応用として、細胞内におけるエンドソ-ム膜融合の測定法の開発を行った。培養繊維芽細胞NRKに蛍光エネルギ-ドナ-(calcein)を取り込ませ、洗浄した後、さらにアクセプタ-(sulforhodamine B)を取り込ませた。先に生成したドナ-を含むエンドソ-ムと、後に生成したアクセプタ-を含むエンドソ-ムが細胞内で融合すると、内水相の混合により共鳴エネルギ-移動が生起し、ドナ-の蛍光寿命が短くなる。
FLIMによって、蛍光寿命をコントラストとする画像を作製すると、細胞中の個々のエンドソ-ムについて融合の程度が一目瞭然となった。その結果、経時的に生成したエンドソ-ム同士に融合能があること、アクセプタ-を含むエンドソ-ムが生成してから10分後には融合が観察され、20分後には多くが融合エンドソ-ムになること、融合は細胞中のいたるところで起こること、等が示された。

研究成果

• [文献書誌] A.Kusumi,A.Tsuji,M.Murata,Y.Sako,A.Yoshizawa,T.Hayakawa and S.Ohnishi: "Devolopment of a streak camera-based time-resolved microscope flnorimetex and its application to studies of menbrane fusion in single cells." Biochemistry. 30. 6157-6527 (1991)
• [文献書誌] W.K.Subczyuski,J.S.Hyde,and A.Kusumi: "Effect of alkyl chain unsaturation and cholesterol intercalation on oxygen transport in menbranes:a pulse ESR spin labeling study." Biochemistry. 30. 8578-8590 (1991)
• [文献書誌] M.Posenkiewicz-Gierula,W.K.Subczynski,and A.Kusumi: "Influence of phospholipid unsaturation on the cholesterol distribution in the membrane:a review." Biochimie. 73. 1311-1316 (1991)
• [文献書誌] Y.Sako,M.Yamamoto,and A.Kusumi: "Nanometer-level analysis of receptor movements has revealed the domain structare of the plasma membraine." Nature.
• [文献書誌] Y.Sako and A.Kusumi: "Intracellnlar regulation of movements of E-oadherin in the plasma membrane." Nature.
• [文献書誌] T.Oida,Y.Sako,and A.Kusumi: "Development of flnorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and its application to the studies of endosome fnsion in single cells." Biophys.J.