哺乳類チトクロムPー450の電子伝達に伴うコンホメ-ションと基質受容性の変化の研究

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02044017
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 旗野 昌弘 東北大学, 非水溶液化学研究所 (50006293)
• 研究分担者: 廣谷 功 東北大学, 非水溶液化学研究所, 助手 (70192721) ; 清水 透 東北大学, 非水溶液化学研究所, 助教授 (40118956) ; 藤井 義明 東北大学, 理学部, 教授 (00098146) ; POULOS Thoma メリーランド大学, 生化学科, 教授
• キーワード: 哺乳類チトクロムPー450 / チトクロムPー450 / 機能・構造相関 / 電子伝達系 / 基質受容性変化 / 遺伝子組換え / タンパク質間相互作用 / X線結晶解析

研究概要

緑膿菌より単離されたチトクロムPー450camのX線結晶解析の成功(T.L.Poulos et al.,J.Biol.Chem.,260巻,p16122〜p16130(1985))は,160種も単離されている他のチトクロムPー450類の機能・構造相関・構造相関の研究に画期的な,しかも重要な指針を与えた。緑膿菌のチトクロムPー450を除き,他のチトクロムPー450はミクロゾ-ム,ミトコンドリア中に存在し,現在までのところ結晶解析の報告はない。我々は肝ミクロゾ-ムのチトクロムPー450d遺伝子の酵母中での発現に成功し(T.Shimizu et al.,FEBS Lett.,207巻,p217〜p221(1986)),さらに約400種のチトクロムPー450dの変異体を調製し,単離した。この科学研費補助金(国際学術研究)の平成元年度により研究分担者であるPoulos教授から未発表のチトクロムPー450cam全原子座標(周辺の水分子も含む)とそれらの熱的揺動デ-タの供与を受け,コンピュ-タ・グラフィクス解析、変異実験,機能解析を行ない,Biochemistry,28巻,p.6848〜p.6857(1989)に論文を発表した。
平成2年度では来日したPoulos教授との討論をふまえ,distal位のGlu319の存在の意味(Biochemistry,30巻,p.1490〜p.1496(1991)),チトクロムPー450とその還元酵素との界面にあるチトクロムPー450中のリシン アルギニン残基の役割(J.Biol.Chem.,印刷中(1991)),基質受容性とアミノ酸配列との関連(Biochemistry,30巻,印刷中(1991))などを明らかにした。また,チトクロムPー450d野生種に対する界面活性剤の効果,オリゴマ-化,モノマ-化の選別,より精製しモノマ-化するカラム材料と溶離剤の選択を完了し,研究分担者の藤井教授がアメリカの学会出席の折,Poulos教授と結晶化の研究をさらに討論し(平成3年4月),平成3年度完了を目指している。

研究成果

• [文献書誌] T.Shimizu,O.Ito,H.Sotokawa,A.J.Md Sadeque,M.Hatano et al.: "Co Binding Studies of wild Type and Mutant Cytoーchrome Pー450_ds:Effects of Mutations at Distal and Proximal sites and of Substrates" Biochemistry. 30. (1991)
• [文献書誌] T.Shimizu,T.Tateishi M.Hatano,and Y.FujiiーKuriyama: "Probing the Role of Lysines and Arginines in the Catalytic Function of Cytochrome pー450_d by SiteーDirected Mutagenesis" J.Biol.Chem.266. (1991)
• [文献書誌] T.Shimizu,A.J.Md Sadeque,G.N.Sadeque,M.Hatano et al.: "Ligand Binding Studied of Engineered Cytochreme pー450_d wild Type,proximal Mutants and distal Mutants" Biochemistry. 30. 1491-1496 (1991)
• [文献書誌] H.Sotokawa,T.Shimizu,H.Furuya,A.J.Md Sadeque,M.Hatano et al.: "Electron Spin Resonance Studies of WildーType and Mutant Cytochrome Pー450_d:Effects of Mutations at Proximal,Aromatic and Distal site on g Values" Biochimica et Biophysica Acta. 1037. 122-128 (1990)
• [文献書誌] H.Furuya,T.Shimizu,K.Hirano,M.Hatano,and Y.Fujiiーkuriyama et al.: "SiteーDirected Mutageneses of Rat Liver Cytochrome pー450_d:Catalytic Activities toward Benzphetamine and 7ーEthoxycoumarin" Biochemistry. 28. 6848-6857 (1989)
• [文献書誌] H.Furuya,T.Shimizu,M.Hatano and Y.FujiiーKuriyama: "Mutations at the Distal,and proximal Sites of Cytochrome Pー450_d Changed RegioーSelectivity of Acetanilide Hydroxylations" Biochemical and Biophysical Research Communications. 160. 669-676 (1989)
• [文献書誌] M.Hatano Ed.: "Protein Structural Analysis,Folding and Design" Japan Scientific Societies Press,Tokyo and Elsevier,Amsterdam, 1-237 (1990)
• [文献書誌] O.Gotoh and Y.FujiiーKuriyama: "in “Basis and Mechanisms of Regulation of Cytochorome Pー450",Ed.by Klaus Ruckpaul and Horst Rein" Taylor & Francis,London, 195-243 (1990)