1991 年度研究成果報告書概要

イオンチャンネルの立体構造と作用機序に関する研究

研究課題

研究課題/領域番号	02044080
研究種目	国際学術研究
配分区分	補助金
応募区分	共同研究
研究機関	京都大学
研究代表者	井本敬二京都大学, 医学部, 助教授 (00176512)
研究分担者	TSIEN Richar スタンフォード大学, 分子細胞生理学教室, 教授 BEAM Kurt G. コロラド州立大学, 獣医学部生理学教室, 教授 STUHMER Walt マックス, プランク生物物理化学研究所・膜生物物理部門, 研究員 MICHEL Hartm マックス, プランク生物物理研究所・膜生化学部門, 部長中井淳一京都大学, 医学部, 助手 (80237198) 福田和彦京都大学, 医学部, 助手 (90199224) 田辺勉京都大学, 医学部, 助手 (70183069)
研究期間 (年度)	1989 – 1991
キーワード	ニコチン性アセチルコリン受容体 / Na^+チャンネル / Ca^<2+>チャンネル / cDNA発現 / 部位特異的変異 / イオン選択性 / 興奮収縮連関 / 電位感受機構
研究概要	cDNAと発現ベクタ-を用いてCHO細胞にニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)サブユニットあるいはムスカリン性アセチルコリン受容体(nAChR I)を発現させ、これらの蛋白を産生する細胞株を得た。遺伝子増幅などの技術を用いて産生蛋白量の増加を図るとともに、大量培養を行いこれらの膜蛋白の精製を検討した。またBaculoウィルス発現系を用いて培養昆虫細胞にnAChRサブユニットを発現させた結果、CHO細胞を用いる発現系に比べて発現効率のよいことが明かとなった。さらに昆虫細胞から精製したnAChRαサブユニットあるいはαサブユニットとδサブユニットからなる複合体を用いて、結晶化のための界面活性剤、pH、温度、沈澱剤などの条件検討を行い、cDNAより大量に発現させた蛋白を用いてX線結晶解析を行うことが現実的に十分可能であることを示した。変異を導入したnAChRチャンネルの解析から、イオン透過速度を決定する中間環のアミノ酸残基がイオン選択に重要であることを見いだした。また内壁形成が予測される部位の電荷を持たない極性アミノ酸残基が環状様構造をなし、近接する中間環と共に短いチャンネル狭小部を構成すると結論した。ウシ骨格筋nAChRα、β、δサブユニットより構成されるチャンネルがアゴニストなしに高頻度に開き、γあるいはεサブユニットを含むチャンネルと比較してイオンの透過特性が異なることから、γおよびεサブユニットがチャンネルの性質を決定する上で重要であることを示した。 Na^+チャンネルのrepeat IのS5とS6の間に位置しテトロドトキシン(TTX)およびサキシトキシン(STX)の感受性に関与することが示されたE387の周辺および他のrepeatの相同部位に変異を導入し、これらの変異がTTX、STX感受性、イオン透過速度、イオン選択性に及ぼす影響を検討した。アスパラギン酸384(D384)の変異、さらにD384およびE387と相同の位置にあるrepeat IIーIVのアミノ酸残基の変異によってもTTX、STXに対する感受性は低下し、これらの2つの相同的部位で正味の負電荷を減少させる変異は、Na^+チャンネルの単一チャンネルコンダクタンスも減少させた。この結果はS5とS6のあいだに位置するこれらのアミノ酸残基集団が、Na^+チャンネルの外側の開口部あるいはチャンネルの内壁を形成することを示唆する。骨格筋および心筋ジハイドロピリジン(DHP)受容体よりなるキメラDHP受容体を作製し、muscular dystrophyマウス骨格筋細胞に発現させたキメラDHP受容体の機能解析から、細胞外液のCa^<2+>を必要としない骨格筋タイプの興奮収縮連関を示すにはrepeat IIとIIIの間の部分が骨格筋由来であることが必要であることを明らかにしmuscular dysgenesisマウス骨格筋細胞に骨格筋、心筋またはキメラDHP受容体を発現させることにより、charge movementが回復することを示した。このことはDHP受容体が興奮収縮連関の電位感受部位であるという仮説を強く支持する。また、骨格筋・心筋キメラDHP受容体の解析から、チャンネル活性化の速度がrepeat Iにより決定させることを明らかにした。脳Ca^<2+>チャンネルのcDNAの一つ(BIと命名)をクロ-ン化し全一次構造を解明した。cDNAより発現させると、チャンネル活性は骨格筋DHP受容体α_2、βサブユニットの同時発現により劇的に増加すること、BIチャンネルは活性化閾値が高くニフェジピンやωコノトキシンに非感受性であることが示された。また遺伝性小脳変性症マウスのRNAの解析より、BIチャンネルは小脳プルキンエ細胞・顆粒細胞に存在することが示唆された。

研究成果
(30件)

すべてその他

すべて文献書誌 (30件)

[文献書誌] Tanabe,T.et al.: "Cardiac-Type excitation-contraction coupling in dysgenic skeletal muscle injected with cardiac dihydropyridine receptor cDNA" Nature. 344. 451-453 (1990)
- 説明
  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Tanabe,T.et al.: "Regions of the skeletal muscle dihydropyridine receptor critical for exitation-contraction coupling" Nature. 346. 567-569 (1990)
- 説明
  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Adams,B.A.et al.: "Intramembranous charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs" Nature. 346. 569-572 (1990)
- 説明
  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Nakai,J.et al.: "Primary structure and functional expression from cDNA of the cardiac ryanodine receptor/calcium release channel" FEBS Lett.271. 169-177 (1990)
- 説明
  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Sakimura,K.et al.: "Functional expression from cloned cDNAs of glutamate receptor species responsive to kainate and quisqualate" FEBS Lett.272. 73-80 (1990)
- 説明
  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Jackson,M.B.et al.: "Spontaneous and agonist-induced openings of an acetylcholine receptor channel composed of bovine muscle α-,β- and δ-subunits" Pflugers Arch.417. 129-135 (1990)
- 説明
  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Higashida,H.et al.: "Selective coupling of different muscarinic receptors to neuronal calcium currents in DNA-transfected cells" Proc.R.Soc.Lond.B242. 68-74 (1990)
- 説明
  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Numa,S.et al.: "Molecular insights into excitation-contraction coupling" Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.55. 1-7 (1990)
- 説明
  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Mori,Y.et al.: "Primary structure and functional exprssion from complementary DNA of a brain calcium channel" Nature. 350. 398-402 (1991)
- 説明
  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Konno,T.et al.: "Rings of anionic amino acids as structural determinants of ion selectivity in the acetylcholine receptor channel" Proc.R.Soc.Lond.B244. 69-79 (1991)
- 説明
  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Tanabe,T.et al.: "Repeat I of the dihydropyridine receptor is critical in determining calcium channel activation kinetics" Nature. 352. 800-803 (1991)
- 説明
  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Pusch,M.et al.: "Single point mutastions of the sodium channel drastically reduce the pore permeability without preventing its gating" Eur.Biophys.J. 20. 127-133 (1991)
- 説明
  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Imoto,K,et al.: "A ring of uncharged polar amino acids as a component of channel constriction in the nicotinic acetylcholine receptor" FEBS Lett.289. 192-200 (1991)
- 説明
  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Terlau,H.et al.: "Mapping the site of block by tetrodotoxin and saxitoxin of sodium channel II" FEBS Lett.293. 93-96 (1991)
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  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Numa,S.: "Neurotransmitter receptors and ionic channels:From structure to function,in "Fidia Research Foundation Neuroscience Award Lectures",Vol.5" Raven Press, 23-44 (1991)
- 説明
  「研究成果報告書概要(和文)」より
[文献書誌] Tanabe, T. et al.: "Cardiac-type excitation-contraction coupling in dysgenic skeletal muscle injected with cardiac dihydropyridine receptor cDNA" Nature. 344. 451-453 (1990)
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  「研究成果報告書概要(欧文)」より
[文献書誌] Tanabe, T. et al.: "Regions of the skeletal muscle dihydropy idine receptor critical for excitation-contraction coupling" Nature. 346. 567-569 (1990)
- 説明
  「研究成果報告書概要(欧文)」より
[文献書誌] Adams, B. A. et al.: "Intramembranous charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs" Nature. 346. 569-572 (1990)
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  「研究成果報告書概要(欧文)」より
[文献書誌] Nakai, J. et al.: "Primary structure and functional expression from cDNA of the cardiac ryanodine receptor/calcium release channel" FEBS Lett.271. 169-177 (1990)
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  「研究成果報告書概要(欧文)」より
[文献書誌] Sakimura, K. et al.: "Functional expression from cloned cDNAs of glutamate receptor species responsive to kainate and quisqualate" FEBS Lett.272. 73-80 (1990)
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  「研究成果報告書概要(欧文)」より
[文献書誌] Jackson, M. B.: "Spontaneous and agonist-induced openings of an acetylcholine receptor channel composed of bovine muscle alpha-, beta- and delta-subunits" Pflugers Arch.417. 129-135 (1990)
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  「研究成果報告書概要(欧文)」より
[文献書誌] Higashida, H. et al.: "Selective coupling of different muscarinic receptors to neuronal calcium currents in DNA-transfected cells" Proc. R. Soc. Lond.B242. 68-74 (1990)
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  「研究成果報告書概要(欧文)」より
[文献書誌] Numa, S. et al.: "Molecular insights into excitation-contraction coupling" Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.1990. 1-7 (1990)
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  「研究成果報告書概要(欧文)」より
[文献書誌] Mori, Y. et al.: "Primary structure and functional expression from complementary DNA of a brain calcium channel" Nature. 350. 398-402 (1991)
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  「研究成果報告書概要(欧文)」より
[文献書誌] Konno, T. et al.: "Rings of anionic amino acids as sstructural determinants of ion selectivity in the acetylcholine receptor channel" Proc, R. Soc. Lond.B244. 69-79 (1991)
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  「研究成果報告書概要(欧文)」より
[文献書誌] Tanabe, T. et al.: "Repeat I of the dihydropyridine receptor is critical in determining calcium channel activation kinetics" Nature. 352. 800-803 (1991)
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  「研究成果報告書概要(欧文)」より
[文献書誌] Pusch, M. et al.: "Single point mutations of the sodium channel drastically reduce the pore permeability without preventing its gating" Eur. Biophys. J.20. 127-133 (1991)
- 説明
  「研究成果報告書概要(欧文)」より
[文献書誌] Imoto, K. et al.: "A ring of uncharged polar amino acids as a component of channel constriction in the nicotinic acetylcholine receptor" FEBS Lett.289. 192-200 (1991)
- 説明
  「研究成果報告書概要(欧文)」より
[文献書誌] Terlau, H. et al.: "Mapping the site of block by tetrodotoxin and saxitoxin of sodium channel II" FEBS Lett.293. 93-96 (1991)
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  「研究成果報告書概要(欧文)」より
[文献書誌] Numa, s.: Raven Press. Neurotransmitter receptors and ionic channels : From structure to function, in "Fidia Research Foundation Neuroscience Award Lectures", Vol. 5, 23-44 (1991)
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  「研究成果報告書概要(欧文)」より

1991 年度 研究成果報告書概要

イオンチャンネルの立体構造と作用機序に関する研究

研究代表者

井本 敬二 京都大学, 医学部, 助教授 (00176512)

研究成果

[文献書誌] Tanabe,T.et al.: "Cardiac-Type excitation-contraction coupling in dysgenic skeletal muscle injected with cardiac dihydropyridine receptor cDNA" Nature. 344. 451-453 (1990)

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[文献書誌] Tanabe,T.et al.: "Regions of the skeletal muscle dihydropyridine receptor critical for exitation-contraction coupling" Nature. 346. 567-569 (1990)

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[文献書誌] Adams,B.A.et al.: "Intramembranous charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs" Nature. 346. 569-572 (1990)

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[文献書誌] Nakai,J.et al.: "Primary structure and functional expression from cDNA of the cardiac ryanodine receptor/calcium release channel" FEBS Lett.271. 169-177 (1990)

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[文献書誌] Sakimura,K.et al.: "Functional expression from cloned cDNAs of glutamate receptor species responsive to kainate and quisqualate" FEBS Lett.272. 73-80 (1990)

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[文献書誌] Jackson,M.B.et al.: "Spontaneous and agonist-induced openings of an acetylcholine receptor channel composed of bovine muscle α-,β- and δ-subunits" Pflugers Arch.417. 129-135 (1990)

説明

[文献書誌] Higashida,H.et al.: "Selective coupling of different muscarinic receptors to neuronal calcium currents in DNA-transfected cells" Proc.R.Soc.Lond.B242. 68-74 (1990)

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[文献書誌] Numa,S.et al.: "Molecular insights into excitation-contraction coupling" Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.55. 1-7 (1990)

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[文献書誌] Mori,Y.et al.: "Primary structure and functional exprssion from complementary DNA of a brain calcium channel" Nature. 350. 398-402 (1991)

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[文献書誌] Konno,T.et al.: "Rings of anionic amino acids as structural determinants of ion selectivity in the acetylcholine receptor channel" Proc.R.Soc.Lond.B244. 69-79 (1991)

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[文献書誌] Tanabe,T.et al.: "Repeat I of the dihydropyridine receptor is critical in determining calcium channel activation kinetics" Nature. 352. 800-803 (1991)

説明

[文献書誌] Pusch,M.et al.: "Single point mutastions of the sodium channel drastically reduce the pore permeability without preventing its gating" Eur.Biophys.J. 20. 127-133 (1991)

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[文献書誌] Imoto,K,et al.: "A ring of uncharged polar amino acids as a component of channel constriction in the nicotinic acetylcholine receptor" FEBS Lett.289. 192-200 (1991)

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[文献書誌] Terlau,H.et al.: "Mapping the site of block by tetrodotoxin and saxitoxin of sodium channel II" FEBS Lett.293. 93-96 (1991)

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[文献書誌] Numa,S.: "Neurotransmitter receptors and ionic channels:From structure to function,in "Fidia Research Foundation Neuroscience Award Lectures",Vol.5" Raven Press, 23-44 (1991)

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[文献書誌] Tanabe, T. et al.: "Cardiac-type excitation-contraction coupling in dysgenic skeletal muscle injected with cardiac dihydropyridine receptor cDNA" Nature. 344. 451-453 (1990)

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[文献書誌] Tanabe, T. et al.: "Regions of the skeletal muscle dihydropy idine receptor critical for excitation-contraction coupling" Nature. 346. 567-569 (1990)

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[文献書誌] Adams, B. A. et al.: "Intramembranous charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs" Nature. 346. 569-572 (1990)

説明

[文献書誌] Nakai, J. et al.: "Primary structure and functional expression from cDNA of the cardiac ryanodine receptor/calcium release channel" FEBS Lett.271. 169-177 (1990)

説明

[文献書誌] Sakimura, K. et al.: "Functional expression from cloned cDNAs of glutamate receptor species responsive to kainate and quisqualate" FEBS Lett.272. 73-80 (1990)

説明

[文献書誌] Jackson, M. B.: "Spontaneous and agonist-induced openings of an acetylcholine receptor channel composed of bovine muscle alpha-, beta- and delta-subunits" Pflugers Arch.417. 129-135 (1990)

説明

[文献書誌] Higashida, H. et al.: "Selective coupling of different muscarinic receptors to neuronal calcium currents in DNA-transfected cells" Proc. R. Soc. Lond.B242. 68-74 (1990)

説明

[文献書誌] Numa, S. et al.: "Molecular insights into excitation-contraction coupling" Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.1990. 1-7 (1990)

説明

[文献書誌] Mori, Y. et al.: "Primary structure and functional expression from complementary DNA of a brain calcium channel" Nature. 350. 398-402 (1991)

説明

[文献書誌] Konno, T. et al.: "Rings of anionic amino acids as sstructural determinants of ion selectivity in the acetylcholine receptor channel" Proc, R. Soc. Lond.B244. 69-79 (1991)

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[文献書誌] Tanabe, T. et al.: "Repeat I of the dihydropyridine receptor is critical in determining calcium channel activation kinetics" Nature. 352. 800-803 (1991)

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[文献書誌] Pusch, M. et al.: "Single point mutations of the sodium channel drastically reduce the pore permeability without preventing its gating" Eur. Biophys. J.20. 127-133 (1991)

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[文献書誌] Imoto, K. et al.: "A ring of uncharged polar amino acids as a component of channel constriction in the nicotinic acetylcholine receptor" FEBS Lett.289. 192-200 (1991)

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[文献書誌] Terlau, H. et al.: "Mapping the site of block by tetrodotoxin and saxitoxin of sodium channel II" FEBS Lett.293. 93-96 (1991)

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[文献書誌] Numa, s.: Raven Press. Neurotransmitter receptors and ionic channels : From structure to function, in "Fidia Research Foundation Neuroscience Award Lectures", Vol. 5, 23-44 (1991)

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1991 年度研究成果報告書概要

井本敬二京都大学, 医学部, 助教授 (00176512)