生体膜に存在するアニオン輸送系の研究ーCl^-とカチオン輸送性ATPaseの比較

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02044101
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 大森 晋爾 岡山大学, 薬学部, 教授 (10032872)
• 研究分担者: SHIOZAWA Jud マックス, プランク生化学研究所・膜生化学部門, 研究員 ; LOTTSPEICH F マックス, プランク生化学研究所・遣伝子センター, 教授 ; OESTERHELT D マックス, プランク生化学研究所・膜生化学部門, 研究所長(教授) ; 二井 将光 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (50012646) ; 池田 己喜子 岡山大学, 薬学部, 講師 (20112154)
• キーワード: Cl^-輸送性ATPase / クロロプラストATPase / 液胞膜ATPase / カサノリ / 遣伝子クロ-ニング / 生化学的解析 / 蛋白質化学的解析

研究概要

1.カサノリのCl^-輸送性AtPaseについて
(1)蛋白質化学的解析:Cl^-輸送性ATPaseのa(54 kDa)及びb(50 kDa)サブユニットをSDSーPAGEにより分離→electroelution→リジルエンドペプチダ-ゼによる消化→逆相HPLCによるフラグメントの精製→N末端からのアミノ酸配列決定を行った。その結果、aサブユニットはFタイプATPaseのαサブユニットに,bサブユニットはβサブユニットに高い相同性を示した。
(2)遣伝子クロ-ニング:上記で得られたアミノ酸配列に基づき数種類のオリゴタヌクレオチドを合成し,これらをプライマ-としてカサノリcDNAバンクのPCRを利用した直接増幅を行った。その結果,a・bサブユニットをコ-ドする可能性のある遣伝子断片が得られた。現在,遺伝子断片の直接塩基配列決定→遺伝子断片の同定を行っている。
2.カサノリのクロロプラスト・液胞膜H^+-ATPaseについて
(1)生化学的研究:クロロプラスト膜画分よりクロロプラストATPaseのαβサブコンプレックス及びαβγ(δε)コンプレックスの分離・精製を行い,ATPaseとしての性質を明らかにした。又,液胞膜画分を部分精製し,vesiclesを調製しATPによって駆動されるH^+輸送活性を証明した。液胞膜ATPaseのA(66 kDa)・B(56 kDa)サブユニットを免疫学的手法を用いて確認した。
(2)遣伝子クロ-ニング:既報のF・VタイプATPaseに保存度の高い領域に対しプライマ-を合成→PCRを上記と同様に行った。Fタイプのα・β,VタイプのA・Bサブユニットをコ-ドする可能性のある遣伝子断片を得た。

研究成果

• [文献書誌] Ikeda,M.,Schmid,R.& Oesterhelt,D.: "A Cl^ーーtranslocating adenosinetriphosphatase in Acetabularia acetabulum 1.Purification and characterization of a novel type of adenosinetriphosphatase that differs from chloroplast CF_1 adenosinetriphosphatase" Biochemistry. 29. 2057-2065 (1990)
• [文献書誌] Ikeda,M.& Oesterhelt,D.: "A Dl^ーーtranslocating adenosinetriphosphatase in Acetabularia acetabulum 2.Reconstituion of the enzyme into liposomes and effect of net charges of liposomes on chloride permeability and reconstitution" Biochemistry. 29. 2065-2070 (1990)
• [文献書誌] 池田 己喜子: "生体膜に存在するアニオン輸送系の解明ーCl^-輸送ATPaseに関する分子生物学的研究" 薬学奨励財団研究成果報告集. 7. (1991)
• [文献書誌] Satoh,S.,Moritani,C.,Ohashi,T.,Ohmori,S.& Ikeda,M.: "Characheristics of chloroplast ATPase in Acetabularia acteapulm: Its difference from the Cl^ーーtranslocating ATPase" Biochim.Biophys.Acta. (1991)
• [文献書誌] Ikeda,M.,Satoh,S.,Maeshima,M.,Mukohata,Y.& Moritani,C.: "A vacuolar ATPase and pyrophosphatase in Acetabularia acetabulm" Biochim.Biophys.Acta. (1991)
• [文献書誌] Moritani,C.,Oesterhelt,D.& Ikeda,M.: "Purification and characterization of a membraneーbound ATPase from Acetabularia cliftonii that corresponds to a Cl^ーーtranslocating ATPase in Acetabularia acetabulum" Eur.J.Biochem. (1991)
• [文献書誌] Iwamoto,A.,Miki,J.,Maeda,M.& Futai,M.: "H^+ーATPase γ subunit of Escherichia coli" J.Biol.Chem.265. 5043-5048 (1990)
• [文献書誌] Takeyama,M.,IHara,K.,Moriyama,Y.,Noumi,T.,Ida,K.,Tomioka,N.,Itai,A.,Maeda,M.& Futai,M.: "The glycinーrich sequence of the β subunit of Escherichia coli H^+ーATPase is important for activity" J.Biol.Chem.265. 21279-21284 (1990)