生体膜に存在するアニオン輸送系の研究ーCL^ーとカチオン輸送性ATPaseの比較

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02044101
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 大森 晋爾 岡山大学, 薬学部, 教授 (10032872)
• 研究分担者: SHIOZAWA Jud マックス, プランク生化学研究所・膜生化学部門, 研究員 ; LOTTSPEICH F マックス, プランク生化学研究所・遺伝子センター蛋白質化学部門, 教授 ; OESTERHELT D マックス, プランク生化学研究所・膜生化学部門, 教授 ; 前田 正知 大阪大学, 産業科学研究所, 助教授 (80190297) ; 二井 将光 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (50012646) ; 池田 己喜子 岡山大学, 薬学部, 助教授 (20112154)
• キーワード: カサノリ / Cl^ー輸送性ATPase / クロロプラストATPase / 液胞型ATPase / ピロフォスファタ-ゼ / sulfate permease / 遺伝子クロ-ニング

研究概要

1.Cl^ー輸送性ATPaseについて:(1)生化学的研究ーCl^ー輸送性ATPaseの再構成系の改良を行い,Cl^ーポンプとしての性質を更に明らかにした。又、ATPアナログによる化学修飾実験により,触媒部位・Cl^ー結合部位はa(54kDa)サブユニットに,輸送部位はb(50kDa)サブユニットに存在する事が示唆された。(2)遺伝子クロ-ニングPCRを利用したcDNAバンクの直接増幅により,aサブユニットから得られたアミノ酸配列と100%一致するDNA断片を得た。bサブユニットについても数種の候補DNA断片を得た。
2.クロロプラストATPaseについて:(1)生化学的研究ー少くともα,βーγサブユニットを含む複合体の精製法を確立し,ATPaseとしての諸性質を調べ,1.との類似点・相違点を明らかにした。(2)遺伝子クロ-ニングーPCRによるcDNAバンクの直接増幅を行い,α・βサブユニットの遺伝子断片を同定した。これらの配列は,高等植物のCF_1ーATPaseの各サブユニットに90%以上の相同性を示した。
3.液胞膜H^+ーATPase・ピロフォスファタ-ゼ(PPase)について:(1)生化学的研究ー粗液胞膜画分の単離を行い,H^+輸送活性の証明・諸性質を調べ,特に,免疫変差反応によりA(66kDa)及びB(56kDa)サブユニットの同定(ATPase)並びにPPase(73kDa)の同定を行った。(2)遺伝子クロ-ニングーPCRによるcDNAバンクの直接増幅を行い,A・Bサブユニットの遺伝子断片を同定した。これらの配列には高等植物液胞型ATPaseの各サブユニットに90%以上の相同性が認められた。
4.硫酸イオン輸送系(sulfate permease)について:細胞レベルでの ^<35>SO_4^<2ー>取り込み実験・遺伝子レベルでの解析によりsulfate permeaseの存在を確認した。

研究成果

• [文献書誌] Ohhashi,T.,Moritani,C.,Andoh,H.,Satoh,S.,Ohmori,S.,Lottspeich,F.& Ikeda,M.: "Preparative high-yield electroelution of proteins after separation by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis and its application to analysis of amino acid sequences and to raise antibodies" J.Chromatogr.585. 153-159 (1991)
• [文献書誌] Ikeda,M.,Satoh,S.,Maeshima,M.,Mukohata,Y.& Moritani,C.: "A vacuolar ATPase and pyrophosphatase in Acetabularia acetabulum" Biochim.Biophys.Acta. 1070. 77-82 (1991)
• [文献書誌] Ohhashi,T.,Katsu,T.& Ikeda,M.: "Improvement of the reconstitution of the Cl^--translocating ATPase isolated from Acetabularia acetabulum into liposomes and several anion pump characteristics" Biochim.Biophys.Acta. (1992)
• [文献書誌] Moritani,C.,Kimura,M.,Satoh,S.,Oesterhelt,D.& Ikeda,M.: "Acetabularia belongs to higher plants?-Identification of PCR fragments encoding chloroplast F_1-ATPase,α and β subunits and vacuolar ATPase,large and small subunits" Planta. (1992)
• [文献書誌] Moritani,C.,Yamauchi,M.,Oesterhelt,D.& Ikeda,M.: "Acetabularia is equipped with sulfate permease:amplification of a 359 bp fragment encoding a putative cysA gene and increase in sulfate uptake caused by sulfate deprivation" FEBS Lett.(1992)