アスパラギン酸アミノ基転移酵素の構造と機能

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02044117
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 森野 能昌 熊本大学, 学長 (30028352)
• 研究分担者: KIRSCH J.F. カルフォルニア大学, 生化学, 教授 ; ARNONE A. アイオワ大学, 生化学, 教授 ; METZLER D.E. アイオワ州立大学, 生化学, 教授 ; 広津 建 大阪市立大学, 理学部, 助教授 (10047269) ; 樋口 泰一 大阪市立大学, 理学部, 教授 (40046868) ; 矢野 貴人 大阪医科大学, 助手 ; 林 秀行 大阪医科大学, 講師 (00183913) ; 倉光 成紀 大阪大学, 理学部, 教授 (60153368) ; 棚瀬 純男 熊本大学, 医学部, 講師 (20112401) ; 鏡山 博行 大阪医科大学, 教授 (80028555)
• キーワード: アスパラギン酸 / アミノ基転移酵素 / ピリドキサ-ル / 遺伝子工学 / アミノ酸残基置換 / 触媒機能 / 基質特異性 / 機能構造相関

研究概要

われわれはAspATに数十種類の変異を導入し、その改変された酵素機能を酵素化学的、蛋白化学的に解析してきた。しかし、変異の導入に伴って起こると推定される極微細な構造変化を直接とらえる手段は、従来の蛋白化学的方法では適用限界があり、X線結晶解析に頼らざるを得ない。一方、X線結晶解析では、酵素構造の動的変化を経時的に観察することは不可能で、主として基質およびアナログとの反応動力学的解析により得られる情報が、デ-タの解釈に不可欠となっている。われわれが提供する変異酵素の結晶構造情報を得ることにより、初めて、人為的な残基置換によって起こる変化を構造と機能の両面からとらえることが可能となる。平成3年度、機能面、構造面、それぞれの研究結果を互いに検討することにより、AspATの触媒機能と構造との相関関係を今後の共同研究で明確にするに十分の手がかりを得ることができ、以後の変異酵素の設計についての有益な情報を得た。森野、棚瀬はブタAspAT変異体を大腸菌菌体内で大量生産し、米国研究者グル-プに郵送しX線による結晶解析とNMRによる観察を行なった。また様々なアミノ酸置換を導入した変異酵素を持参して渡米し結晶化を行なった。鏡山、倉光、林、矢野らは大腸菌AspATについて、活性中心部位に存在し基質結合と基質特異性の発現に関与するアミノ酸残基に変異を導入し機能を調べた。基質結合と基質特異性の発現に関与するアミノ酸残基、個々の役割について変異酵素での実験結果をもとに、Kirschらと討論を行なった。樋口、広津らは、米国X線結晶解析グル-プと大腸菌およびブタ酵素に関する結晶デ-タの詳細な検討を行なった。

研究成果

• [文献書誌] Inoue,K.: "Tyr225 in aspartate aminotransferase:contribution of the hydrogen bond between Tyr225 and coenzyme to the catalytic reaction." J.Biochem(Tokyo). 109. 570-576 (1991)
• [文献書誌] Yano,T.: "The role of His143 in the catalytic mechanism of Escherichia coli aspartate aminotransferase." J.Biol.Chem.266. 6079-6085 (1991)
• [文献書誌] Higaki,T.: "Porcine cytosolic aspartate aminotransferase reconstituted with 〔4'-13C〕pyridoxal phosphate." Biochemistry. 30. 2519-2526 (1991)
• [文献書誌] Fukumoto,Y.: "Structural and functional role of the amino-terminal region of porcine cytosolic aspartate aminotransferase." J.Biol.Chem.266. 4187-4193 (1991)
• [文献書誌] Planas,A.: "Reengineering the catalytic lysine of aspartate aminotransferase by chemical elaboration of a genetically introduced cysteine." Biochemistry. 30. 8268-8276 (1991)
• [文献書誌] Kintanar,A.: "NMR Observation of exchangeable protons of pyridoxal phosphate and histidine residues in cytosolic aspartate aminotransferase." J.Biol.Chem.266. 17222-17229 (1991)