複合フラビン酵素の高次構造

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02044123
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 西野 武士 横浜市立大学, 医学部, 助教授 (40094312)
• 研究分担者: PAI Emil F. トロント大学, 医学部, 教授 ; 天谷 吉宏 横浜市立大学, 医学部, 助手 (50193032)
• キーワード: キサンチン酸化酵素 / 複合金属フラビン酵素 / 高次構造 / 発現酵素 / バキロウィ-ルスベクタ- / モリブドプテリン

研究概要

1.前年度結晶が一方向は単一の回折パタ-ンが得られたが、もう一面が二重であり、所謂単結晶ではなかったため、結晶条件を吟味しよりよい結晶をうるため相当苦労したが、酵素精製を吟味し比較的よい結晶がえられた。しかし、結晶はXー線に弱く、一般に大きな分子量(サブユニット15万、合計30万)の結晶はそのような傾向を示す場合がある。これを克服するためサイクロトロンを用いた解析が必要となった。実験の進行は当初計画より遅れているが次年度中に基本的デ-タを集めたい。また、今までの酵素が牛ミルク酵素であったが、精製途中にプロテア-ゼを含むため酵素の性質が分子的に均一でない可能性があり、現在ラット由来の酵素の結晶化を試みている。
2.cDNA発現系の開発は順調に進行中である。ラット酵素cDNAを大腸菌で発現させたところ酵素蛋白の大量発現はみられたものの、活性は示さずおおくは不溶性蛋白となってしまった。そこで、バキロビ-ルス・昆虫細胞の発現系を用いた結果、蛋白は可溶性となった。しかし、酵素活性は殆ど示さなかった。培養液の組成を吟味した結果、金属の取り込みに問題があることがわかった。培養液にモリブデン、鉄を加えることにより酵素活性の発現をみた。しかし、精製酵素ほどの比活性は示さず、完全活性型の約10%程度であった。その大部分はモリブドプテリンに異常があった。このことは酵素の補欠分子族のモリブデン、非ヘム鉄の形成に関係しており興味深い結果である。現在cDNAの塩基配列を一部改変した変異酵素の作成に取り掛かっている。

研究成果

• [文献書誌] K.Shirabe,T.Yubusui,T.Nishino & M.Takeshita: "Role of cystein residues in human NADH-cytochrome b_5 reductase studied by site directed mutagenesis" J.Biol.Chem.266. 7531-7536 (1991)
• [文献書誌] M.Ichikawa,T.Nishino,T.Nishino & A.Ichikawa: "Subcellular localization of xanthine oxidase in rat hepatocytes" J.Histochem.Cytochem.
• [文献書誌] T.Saito,V.Massey & T.Nishino: "A light product of 6-azido FAD reconstituted with milk xanthine oxidase" Biochemistry.
• [文献書誌] T.Nishino,M.Sato,E.F.Pai: "Crystallization of milk xanthine oxidase" J.Mol.Biol.
• [文献書誌] T.Nishino: "Flavins and Flavoproteins" Walter de Gruyter,Berlin, 885-894 (1991)
• [文献書誌] T.Nishino & I.Tamura: "Advance in Exp.Med.Biol." Plenum Press,New York,