新しいがん遺伝子検索用細胞の確立

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02152067
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 三好 淳 大阪大学, 微生物病研究所・発癌遺伝子検索細胞センター, 助手 (80166214)
• キーワード: がん遺伝子 / <cot>___ー遺伝子 / タンパク質キナ-ゼ / ハムスタ-SHOK細胞 / DNAトランスフェクション / 形質転換 / 甲状腺がん / 遺伝子クロ-ニング

研究概要

本研究の一環として、ハムスタ-SHOK細胞系を確立した。本年度は、これを用いてヒト甲状腺癌細胞より分離された新しいがん遺伝子<cot>___ーの生化学的活性とその活性化機構を明らかにした。
<cot>___ーがん遺伝子のcDNA塩基配列から予想される蛋白は、protein kinase群と43ー45%の類似性を有し、Kinase活性に必須と考えられている15のアミノ酸を保存していることが分かっていた。そこで、この蛋白のKinase活性を検出するため2通りの解析を行なった。第一に、<cot>___ーがん蛋白のN末端側にネコ肉腫ウイルスGRーFeSVの<gag>___ー遺伝子産物を融合させたキメラ遺伝子を試験管内で作成し、<gag>___ー蛋白に対する抗体を利用して、形質転換細胞の抽出液中の<gag>___ーー<cot>___ー融合蛋白P60を免疫沈降させ、in vitro自己リン酸化活性を見いだした。第二に、cot蛋白のN末端とC末端側に対応する合成ペプチドに対する抗体を用いて、同様にcot蛋白P52の自己リン酸化活性を検出した。いずれの場合も、自己リン酸化はserine残基に生じており、<cot>___ーがん遺伝子はscrine/thrconine kinase系のがん遺伝子であることが明らかになった。
<cot>___ーがん遺伝子の活性化機構を解明するために、ヒト胎盤DNA、甲状腺がん細胞、およびSHOK形質転換細胞における<cot>___ー遺伝子の構造および8個のexonの全DNA塩基配列を比較した。その結果、ヒト胎盤DNAと甲状腺癌細胞における<cot>___ー遺伝子の構造には変化が認められないのに対し、<cot>___ーがん遺伝子では、3'領域の組換部位が第8exon内に存在することが分かった。従って、<cot>___ーがん遺伝子産物は正常<cot>___ー遺伝子産物のC'ーterminal truncationを受けたものに相当すること、また、<cot>___ーがん遺伝子の活性化は、甲状腺がん細胞DNAのSHOK細胞へのtransfectionに際して生じたものであることが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Terada,N.,et al.: "Alteration of Nー<ras>___ー gene mutation after relapse in acute lymphoblastic leukemia." Blood. 75. 453-457 (1990)
• [文献書誌] Higashi,T.,et al.: "Hamster cell line suitable for transfection assay of transforming genes." Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87. 2409-2413 (1990)
• [文献書誌] Orita,S.,et al.,: "A novel point mutation at codon 146 of the Kー<ras>___ー gene in a human colorectal cancer identified by the polymerase chain reaction." Virus genes. 5. 75-79 (1991)
• [文献書誌] Miyoshi,J.,et al.,: "Structure and transforming potential of the human <cot>___ー oncogene encoding a putative protein kinase." Mol.Cell.Biol.