| 研究課題/領域番号 |
02205098
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| 研究機関 | 九州工業大学 |
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研究代表者 |
加藤 安彦 九州工業大学, 工学部, 教授 (90039040)
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| 研究分担者 |
柿本 幸司 九州工業大学, 工学部, 助手 (00117300)
木藤 武利 九州工業大学, 工学部, 教授 (10039076)
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| キーワード | 固定化融合タンパク / 改変ホスファタ-ゼ / 認識機能タンパク / 有機リン酸センサ / 精密分離法 / 部位特異的変異phoA |
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| 研究概要 |
研究目的を達成するための融合タンパクのモデルとして、光合成能がリン酸イオン量に依存するクロロプラスト(またはチラコイド)にアルカリホスファタ-ゼを組み合わせた融合タンパク系を選んだ。このようなタンパク系を固定化し、有機リン酸化合物検出用バイオセンサの構築を主目的とする。さらに、触媒活性喪失アルカリホスファタ-ゼとピエゾ振動子を組み合わせた有機リンセンサの構築も試み、両者の性能を比較検討する。
1)チラコイドの単離、精製および固定化
チラコイド分画の単離・精製は、ホウレンソウ、レタスを材料として既知の方法で行った。単離したチラコイド分画はきわめて不安定で、約1〜2日間で完全に失活した。そこでチラコイドとアルカリホスファタ-ゼを混合し、ゼラチンーグルタルアルデヒド架橋ポリマー中に固定化したところ、かなり良好な結果が得られた。
2)変異アルカリホスファタ-ゼ遺伝子の作成と大腸菌の導入
プラスミドpHIーlDNAを制限酵素HindIIIーSalIで処理してアルカリホスファタ-ゼ遺伝子(phoA)断片を得た。この断片をM13mp9ファ-ジに組み込み、大腸菌BMH71ー18にトランフェクションした。目的ファ-ジを選択後、そのDNAを鋳型としてgapped duplex法で、活性中心をなす102番目のセリンをそれぞれアラニンおよびグリシンに改変した。こうして得られた改変phoA遺伝子を、HindIII、BamH Iで切り出してPBR322プラスミドに組み込んだ後、大腸菌SM547株に導入した。
プラスミドを持つ大腸菌SM547株を無機リン酸濃度を低減した培地で培養し、その菌体からペリプラズム分画を得た。ペリプラズム分画の中に変異アルカリホスファタ-ゼに相当するタンパク分画が存在することを、SDSーアクリルアミド電気泳動法で確認した。
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