転写制御因子の超微量蛋白質レベルでの一次構造、並びにDNA結合部位の同定

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02258220
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 次田 晧 東京理科大学, 総合研究所, 教授 (00028284)
• 研究分担者: 加茂 政晴 東京理科大学, 総合研究所, 助手 (40214564)
• キーワード: 転写制御因子 / 超微量蛋白質 / アミノ酸配列 / DNA結合部位 / マウスB細胞 / ホメオドメイン

研究概要

マウスB細胞のDNAのプロモ-タ-及びエンハンサ-に存在するdecamer配列に特異的に結合する因子として、CBFー1(100kDa)及DBFー2(30ー35kDa)の2種類のタンパク質を得えた。DBFー1については、N末端からの一次構造の決定を行い、その知見に基ずいてクロ-ニングを行った。DBFー1のDNA結合部位については、V8プロテア-ゼにより、約3kDaの大きさのDNA結合領域を持つフグメントを得た。次にdTの代わりにBrdUに置換した上述のdecamer配列に、さらに末端にP32で標識しpoly dAを結合したDNAを合成した。DNAと転写制御因子をインキュベ-トしたのち光架橋法により、DNAとタンパク質とを共有結合した。プロテア-ゼでこの複合体を分解後、オリゴdTカラムによりdAのついたDNAを含むペプチドを核抽出液から直接分画して、DNA結合タンパク質フラグメントを得た。最終的な精製をDNAのP32を目印としてSDSーPAGEで行、そのバンドのアミノ酸配列を決定した。その結果このフラグメントは、ホメオドメインの配列とほぼ一致した。マウスDBFー1は、この領域においてヒトのoctamer結合蛋白質とほぼ等しく、decamer結合ホメオドメインが高度に保存されていることを示した。我々の案出した高感度化配列決定法では従来のPTH法と比べて1/50量である100fモルの蛋白試料で市販シ-エンサ-を用いてDNA存在下で10段階のシ-クエンスを決定することが出来た。さらにペプチドと共存するDNAによる阻害は見られない、この方法に改良を加え、アミノ酸同定を妨害する副生成物について研究を行い、試薬のTFAをHFBAに変える事によりその副産物生成を押さえ、HPLCの感度を上げることに成功した。また微量蛋白質の脱塩及び濃縮方法として古典的なTCA沈澱法が有効である事も合わせて示した。5%または20%(w/v)TCAを用いて30分ないしは16時間放置後、沈澱した蛋白質をエ-テルで洗浄してTCAを除去する操作により脱塩を行う方法を確立した。

研究成果

• [文献書誌] Tsugita,A.: "Highly sensitive determination of amino acid derivatives obtained from Nーterminal sequence." J.Protein Chemistry. 9. 253-254 (1990)
• [文献書誌] 次田 晧: "超微量分析の現状と展望" 化学増刊117号. 209-218 (1990)
• [文献書誌] Tsugita,A.and Kamo,M.: "Sensitive Determination of Amino Acid Derivatives Obtained from Nーterminal Sequence Analysis" Proceeding of the 8th lnternational Conference on Method in Protein Sequence Analysis. (1991)
• [文献書誌] Tsugita,A.,Kamo.M.,Yano,K.and Yano,H.: "Potein Microーcharacterization" Adv.Biotech.Mol.Biol. (EDs Wei,Y.H.& Chak,K.F.) Natl.Sci.Council Monograph.Ser No.15. 31-40 (1990)
• [文献書誌] Brack,Ch.,Ostermayer,M.,Wichser,U.,Kamo,M.,Shikama,N.and Tsugita,A.: "Rapid isolation of specific DNAーbinding proteins and their DNAーbinding domains for protein microsequencing." (1991)
• [文献書誌] Yano,H.Aso,K.,& Tsugita,A.: "Further study on gas phase acid hydrolysis of protein:improvement of recoveries for tryptophan,tyrosine and methionine" J.Biochem.108. 579-582 (1990)