| 研究概要 |
本研究では大腸菌を材料としtype II topoisomeraseの染色体分配における機能を理解する事を目的に、我々が発見した新しいtopoisomerase,topo IVについて解析を行なった。
これまでの研究よりtopoisomeraseをcodeしている事が示唆されていたparC,parE遺伝子の産物、ParC,ParE蛋白質が実際に、ちょうどgyraseのようにtopoisomeraseを構成しているかどうかを知るために、二つの蛋白質の精製を行なった。精製された標品を用いて調べたところATP,Mg^<2+>存在下でtopoisomerase活性が検出され、確かにこれらがこれまでに同定されていなかった新しいtype II topoisomeraseである事が明らかになり、大腸菌では四番目の新しいtopoisomeraseであるので我々はtopo IVと名付けた。topo IVはnegativeとpositiveの両方のsupercoiled DNAに対してrelaxation活性を持っているが、gyraseの持つようなsupercoiling活性はこれまでのところ検出されていない。またrelaxation活性に比べるとunknotting活性は比較的強い。topo IVのsubunit、ParC,ParE蛋白質はそれぞれgyraseのsubunit,GyrA,GyrB蛋白質と高い相同性を持っているが、subunitを交換してもin vitroでtopoisomerase活性は検出されないのでsubunitの互換性はないと考えられる。これはin vivoでの相補試験の結果とも一致する。さらにtopo IV及びgyraseの細胞内での局在性、量についての知見を得るためにこれら4つのsubunit(GyrA,GyrB,ParC,ParE)に対する抗体を調製した。細胞を分画しWestern blottingにより調べたところParC蛋白質についてはMg^<2+>存在下で内膜およびDNAと複合体を作るという興味深い性質が明らかになった。GyrA,GyrB蛋白質についてはParCほどはっきりした局在性を示さず、ParCのこの性質の意味についてはまだはっきりしないがtopo IVにuniqueな性質である。またParE蛋白質は細胞のこわし方によっては非常に不安定である事も解かった。さらに細胞内での量を抗体を用いて概算したところ、ParE蛋白質がやや少なめではあるがその他はほぼ同じぐらいの量が存在していると推測された。またtopo IVのmutantにgyrA,gyrBを持つplasmidを入れたときに欠損が一部suppressされる事が解かり、gyraseとtopo IVには共通の機能がある事が明らかになった。おそらくtopo IVはrelaxationと染色体分配に、gyraseはsupercoilingと染色体分配に働き、染色体分配における少なくとも一部の役割(decatenationなど)が共通なのではないかと思われる。
以上、今年度の研究によりtopo IVの存在が確かめられ、いくつかの基本的な性質が明らかになってきた。
|
