| 研究課題/領域番号 |
02263201
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
岩井 成憲 北海道大学, 薬学部, 助手 (10168544)
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| 研究分担者 |
紙谷 浩之 北海道大学, 薬学部, 教務職員 (10204629)
井上 英夫 北海道大学, 薬学部, 助教授 (80088856)
大塚 栄子 北海道大学, 薬学部, 教授 (80028836)
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| キーワード | T4エンドヌクレア-ゼV / オリゴデオキシリボヌクレオチド / チミンダイマ- / リン酸ジエステル / ホスホロジチオエ-ト / ホスホロチオエ-ト / 酵素ー基質複合体 |
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| 研究概要 |
チミジン2量体に光照射を行うことにより得られた結合ユニットを用いて、チミンダイマ-を含むドデカデオキシリボヌクレオチド(dGCACGT[]TGCACG、T[]Tはチミンダイマ-)と、チミンダイマ-部分にリン酸ジエステル結合中の2つの酸素が硫黄に置換されたホスホロジチオエ-ト結合を含むアナログ(dGCACGT[_<PS2>]TGCACG、T[_<PS2>]Tはホスホロジチオエ-ト結合を有するチミンダイマ-)を合成した。相補鎖12mer(dCGTGCAACGTGC)も合成して2本鎖とした後、T4エンドヌクレア-ゼVの基質として用いた。
Filter binding assayにより酵素ー基質複合体の解離定数を求めると、T[]Tー12merを用いた場合には1.6×10^<ー8>M、T[_<PS2>]Tー12merでは2.3×10^<ー8>Mとなり、酵素との結合に関してはほとんど同じであることがわかった。切断反応について調べると、T[_<PS2>]Tー12merはT[]Tー12merと比較して明らかに切断速度が遅かった。ホスホロジチオエ-ト結合を有する基質アナログの場合のは、一旦切断された後Sーアルキル化により再び結合することによって見かけの反応速度が低下する可能性があるため、3'位の酸素を硫黄に変えたアナログ(dGCACGT[_<SP>]TGCACG、T[_<SP>]Tは3'ーチオチミジン由来のホスホロチオエ-ト結合を有するチミンダイマ-)を合成した。これを用いた場合には、K_d=2.7×10^<ー7>Mとなり、酵素との結合性が低下することが明らかになった。
以上の結果、チミンダイマ-部分のリン酸ジエステル結合に関しては、3'側の酸素が酵素と相互作用している、すなわち水素結合を形成していると考えられる。
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