分裂酵母<jun>___ーAPー1様因子<pap^<1+>>___ー遺伝子産物の構造解析と作用機構の解明

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02263207
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 登田 隆 京都大学, 理学部, 助手 (50197894)
• キーワード: 分裂酵母 / APー1様因子 / 転写因子 / Cキナ-ゼ / ロイシンジッパ- / 染色体 / DNA結合タンパク質 / T7ープロモ-タ-

研究概要

分裂酵母pap^<1+>遺伝子は、7残基ごとにロイシンが5回繰り返す典型的なロイシンジッパ-構造をもつタンパク質である。しかもロイシンリピ-トの直前には塩基性アミノ酸(リジン、アルギニン)に富む領域が存在し構造的にホニュウ類のjun,fosといった転写因子に酷似している。pap^<1+>は元来高発現により、Cキナ-ゼ阻害剤スタウロスポリンに対し耐性を付与する遺伝子として単離された。コ-ディング領域の約80%をT7プロモ-タ-下につなぎ、大腸菌で融合タンパク質を発現させた。そのpap^<1+>融合タンパク質を用いた実験から以下のことが明らかになった。
1)ゲルシフト法により、pap^<1+>タンパク質がAPー1配列(TGACTC/AA)に効率よく結合すること。
2)DNAaseIフットプリント法により、SV40プロモ-タ-のAPー1部位にpap^<1+>タンパク質が確かに結合すること。
3)溶液中で二量体を形成していること。
以上のことから、pap^<1+>が分裂酵母のAPー1因子であることが証明された。
さらに既知の分裂酵母遺伝子の塩基配列をコンピュ-タ-検索した結果、プロモ-タ-部位に完全なAPー1配列(TGACTAA)をもつ遺伝子を発現した。この遺伝子は25kdのタンパク質をコ-ド(p25)し、染色体構造に異常をきたすcrml変異細胞中で異常蓄積するタンパクとして同定されていた。p25の特異的抗体、及びNovthern法による解析から、p25の発現がpap^<1+>に完全に依存していることが明らかになった。すなわち、
a)pap^<1+>を高発現している細胞では、p25の量も数倍上昇していた。
b)pap^<1ー>欠損細胞では、p25はほとんど検出できなかった。
以上のことから、p25はpap^<1+>転写因子のタ-ゲット遺伝子の1つであることが示された。

研究成果

• [文献書誌] T.Toda: "Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an APー1ーlike transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast <FUS3>___ー and <KSS1>___ー kinases." Genes Dev.5. 60-73 (1991)
• [文献書誌] T.Toda: "The fission yeast <pap1^+>___ー gene encodes an APー1ーlike factor that functionally interacts with a novel protein kinase." J.Cell Biochem.suppl.14B. 149-149 (1990)
• [文献書誌] H.Ohkura: "The fission yeast <dis2^+>___ー gene required for chromosome disjoining encodes one of two putative type I protein phosphatases." Cell. 57. 997-1007 (1989)
• [文献書誌] T.Hirano: "Essential roles of the RNA polymerase I largest subunit and DNA topoisomerases in the formation of fission yeast nucleolus." J.Cell Biol.108. 243-253 (1989)
• [文献書誌] T.Toda: "Genetic analyses of fission yeast mutants superーsensitive to the inhibitors of protein kinase C." J.Cell Biol.107. 720a-720a (1988)
• [文献書誌] N.Ohkura: "Coldーsensitive and caffeineーsupersensitive mutans of the <Scizosaccharomyces pombe dis>___ー genes implicated in sister chromatid separation durine mitosis." EMBO.J.7. 1465-1473 (1988)
• [文献書誌] T.Toda: "Oxford Surveys on Eukaryotic Genes.The cAMPーdependent protein kinase genes in yeast 5(133ー161)" Oxford Press N.Maclean eds., 281 (1988)