細菌が生産するプロテア-ゼインヒビタ-機能構造についての蛋白工学的研究

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02305003
• 研究機関: 学習院大学
• 研究代表者: 三浦 謹一郎 学習院大学, 理学部, 教授 (30000227)
• 研究分担者: 赤坂 一之 京都大学, 理学部, 助教授 (50025368) ; 外村 辨一郎 京都大学, 農学部, 教授 (20026545) ; 甲斐荘 正恒 東京都立大学, 理学部, 助教授 (20137029) ; 太田 隆久 東京大学, 農学部, 教授 (30011844) ; 三井 幸雄 長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (40012637)
• キーワード: 蛋白工学 / 酵素阻害剤 / プロテア-ゼ・インヒビタ- / 部位指定変異 / バクテリア / 遺伝子工学 / 蛋白質の機能部位 / 蛋白質の構造

研究概要

蛋白質は生物体の中での諸機能に中心的役割を果たすが、その活性化や代謝に関係する蛋白質分解酵素プロテア-ゼとそのインヒビタ-の機能に必要な構造を特定の材料について共同研究している。主に用いている系は細菌由来の系で、特に放線菌由来のズブチリシンとその阻害剤SSI(Streptomyces Subtilisin Inhibitor)であるが、遺伝子操作を利用した改造により特異性を変換させることに成功した。今年度特に進んだ点はこのような改変SSIの構造変化や相手プロテア-ゼとの相互作用を核磁気共鳴NMRやカロリメトリ-などにより詳細に調べる研究が成果を示しはじめたことである。プロテア-ゼとSSI改変体の種々の組み合せによる複合体を結晶化し、X線解析を進める点でも前進があった。ここで研究しているプロテア-ゼインヒビタ-が蛋白質でありながらなぜプロテア-ゼによって分解されないかを明らかにするための研究でも成果が得られた。たとえばフレキシブルル-プと呼ばれる反応部位付近のル-プ状の張り出し構造を短くしたり長くすることが活性低下に導くことや、ダイマ-形成に必要なβーシ-ト構造に歪みを起こさせることが活性低下を引き起こすことなどが明らかになった。このような研究を進めるために異なった専門家による同一対象の総合研究は非常に役立っているといえる。遺伝子工学的改変蛋白質の作製は蛋白質の構造ー機能相関の研究に有用であるが、このグル-プの最近の結果のように効果的に用いられた例は極めて少い。
この研究班では一方でSSI以外に細菌またはかび類由来のプロテア-ゼ・インヒビタ-の検索とキャラクタリゼ-ションを行なっており、改造研究にも役立てようとしている。それはプロテア-ゼ・インヒビタ-としての構造上の共通性と相違点の二面を知ることにより、機能に必要な構造を解析するためのヒントを与えるからである。

研究成果

• [文献書誌] S.Taguchi,K.Nishiyama,I.Kumagai,H.Momose,K.Miura: "Relationship between ntilization of dual translation initiation signals and protein processing in Streptomyces" Mol.Gen.Genet.226. 328-331 (1991)
• [文献書誌] S.Kojima,Y.Nishiyama,I.Kumagai,K.Miura: "Inhibition of Subtilisin BPN' by Reaction Site P1 Mutants of Strptmyces Subtilisin Inhibitor" J.Biochem.109. 377-382 (1991)
• [文献書誌] Y.Takeuchi,S.Noguchi,Y.Satow,S.Kojima,I.Kumagai,K.Miura,K.Nakamura,Y.Mitsui: "Molecular recognition at the active site of subtilisin BPN': crystallographic studies using genetically engineered proteinaceous inhibitor SSI(Streptomyces subtilisin inhibitor)" Protein Engineering. 4. 501-508 (1991)
• [文献書誌] A.Tamura,K.Kanaori,S.Kojima,I.Kumagai,K.Miura,K.Akasaka: "Mechanisms of Temporary Inhibition in Streptomyces Subtilisin Inhibitor Induced by an Anino Acid substitution,Tryptophan 86 Replaced by Histidine" Biochemistry. 30. 5275-5286 (1991)
• [文献書誌] A.Tamura,K.Kimura,H.Takahara,K.Akasaka: "Cold Denaturation and Heat Denaturation of Streptomyces Subtilisin Inhibitor. 1.CD and DSC Studies" Biochemistry. 30. 11307-11313 (1991)
• [文献書誌] A.Tamura,K.Kimura,K.Akasaka: "Cold Denaturation and Heat Denaturation of Streptomyces Subtilisin Inhibitor. 2.H NMR Studies" Biochemistry. 30. 11313-11320 (1991)
• [文献書誌] 三浦 謹一郎,京極 好正,菊池 正和,松浦 良樹 編 三井 幸雄,甲斐荘 正恒,荒田 洋治,三浦 謹一郎 他著: "蛋白質工学の進展ー蛋白質の設計をめざして(蛋白質・核酸・酵素増刊475巻)" 共立出版, 498 (1992)