高度好熱菌を利用したタンパク質の温度適応の分子的機構

1993 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02403029
• 研究機関: 東京工業大学
• 研究代表者: 大島 泰郎 東京工業大学, 生命理工学部, 教授 (60167301)
• 研究分担者: 山岸 明彦 東京工業大学, 生命理工学部, 助手 (50158086) ; 若木 高善 東京工業大学, 生命理工学部, 助手 (70175058)
• キーワード: タンパク質安定化設計 / 高度好熱菌 / 実験室内進化 / 部位特異的変異 / イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ / カナマイシン耐性酵素

研究概要

イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをモデルたんぱく質として、高度好熱菌Thermus thermophilusの生産する熱安定酵素を解析することにより、酵素たんぱく質の安定化設計を試みた。大腸菌の酵素はサブユニット間の相互作用において、疎水性相互作用が弱いと推定されたので、これを強化するよう部位特異的変異を設計した。その結果得られた変異酵素たんぱく質は熱安定であり、好熱菌を手本とする分子設計に成功した。その主たる耐熱化機構もサブユニット間の結合が堅くなって、分子全体の安定性が上がっていると解析された。
全く別の好熱菌を用いたたんぱく質の耐熱化設計法として、好熱菌を宿主とする遺伝子操作系を開発し、これを用いた実験室内進化を試みてきたが、この面でも成功を収めた。すなわち、T.thermophilusからイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子を完全に欠損させ、この変異株を宿主として、大腸菌の遺伝子など耐熱性の低いイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入し、連続培養により耐熱性を獲得した株に進化してくるのを待つ。このやり方で耐熱化に成功した。さらに、この方法が特定の遺伝子や遺伝子座位に限らないことを証明するため、ピリミジン生合成系の遺伝子座位を取り上げ、構造遺伝子の完全欠損株を取得した。また、中等度好熱菌由来のカナマイシン耐性遺伝子を取り上げ、これを高度好熱菌の宿主に導入して、カナマイシン遺伝子産物の耐熱化にも成功した。

研究成果

• [文献書誌] T.OSHIMA,K.NUMATA,Y.HAYSHI,H.KIRINO 他: "Stabilization of enzyme proteins:A case study using 3-isopropylmalate dehydrogenase" Protein Eng.6(8). 1003 (1993)
• [文献書誌] S.AKANUMA,A.YAMAGISHI,T.OSHIMA: "Thermostabilization of chimeric 3-isopropylmalate dehydrogenase by random mutagenesis" Protein Eng.6(8). 1011-1012 (1993)
• [文献書誌] K.MIYAZAKI,T.OSHIMA: "Tyrosine-139 in Thermus thermophilus 3-isopropylmalate dehydrogenase is involved in catalytic function" FEBS Letters.332. 37-38 (1993)
• [文献書誌] T.TAKADA,S.AKANUMA,T.KOTSUKA,M.TAMAKOSHI 他: "Recombination dficient mutants isolated from an extreme thermophile,Thermus thermophilus" Appl.Environ.Microbiol. 59. 2737-2739 (1993)
• [文献書誌] K.MIYAZAKI,K.KAKINUMA,H.TERASAWA,T.OSHIMA: "Kinetic analysis on the substracte specificity of 3-isopropylmalate dehydrogenase" FEBS Letters.332. 35-36 (1993)
• [文献書誌] S.KOND,A.YAMAGISHI,T.OSHIMA: "A Physical Map of the sulfur-Dependent Archaebacterium,Sulfolobus acidocaldarius 7 Chromosome" J.Bacteriol. 175. 1532-1536 (1993)