分泌型タンパク質の膜透過の分子機構

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02404013
• 研究分野: 応用微生物学・発酵学
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 水島 昭二 東京大学, 応用微生物研究所, 教授 (50013313)
• 研究分担者: 内田 欣哉 東京大学応用微生物研究所, 助手 (60013330) ; 松山 伸一 東京大学応用微生物研究所, 助手 (50183108) ; 徳田 元 東京大学応用微生物研究所, 助教授 (40125943)
• キーワード: タンパク質の分泌 / タンパク質の膜透過 / 再構成 / SecA / SecY / SecE / プロトン駆動力 / 大腸菌

研究概要

1.再構成系の改良:再構成条件を種々検討した。リン脂質の調整法によって再構成活性に顕著な違いがでることを明らかにした。これらの成果をもとに、再構成条件をより安定化することに成功した。また後述するように、精製SecA、SecY、SecEよりの再構成に成功した。
2.分泌装置を構成する膜内因子の同定:SecY、SecEを精製した。これらを用いた再構成実験よりSecY、SecEは必須の透過因子であることを明らかにした。また、SecD、SecFの大量生産に成功し、精製を行っている。目下これらのタンパク質の膜透過反応への関与について研究している。
3.SecAのATP、前駆体タンパク質との相互作用ドメインを明らかにした。またSecAがこれらの分子と相互作用することにより構造変化を起すことを明らかにした。
4.SecY、SecEの機能:前述のように再構成実験によってこれらが必須の成分であること、この2つが膜内にあればSecA、ATPの存在下で膜透過が起ることを明らかにした。
5.エネルギ-の関与:シグナルペプチド切断部位の構造が切断とは関係なく、膜透過のプロトン駆動力要求性と密接な関係にあることを明らかにした。
6.シグナルペプチド各ドメインの役割:中央疎水領域の長さ、疎水性の全量がシグナルペプチドの機能と密接に関係していることを明らかにした。
7.膜透過とタンパク質のフォ-ルディング:この課題についての研究はあまり進まなかった。

研究成果

• [文献書誌] Sasaki,S.,Matsuyama,S.and Mizushima,S.: "In vitro kinetic analysis of the role of the positive charge at the aminoーterminal region of signal peptides in translocation of secretory protein across the cytoplasmic membrane in Escherichia coli." J.Biol.Chem.265. 4358-4363 (1990)
• [文献書誌] Matsuyama,S.,Kimura,E.and Mizushima,S.: "Complementation of two overlapping fragments of SecA,a protein translocation ATPase of Escherichia coli,allows ATP binding to its aminoーterminal region." J.Biol Chem.265. 8760-8765 (1990)
• [文献書誌] Akita,M.,Sasaki,S.,Matsuyama,S.and Mizushima,S.: "SecA interacts with secretory proteins by recognizing the positive charge at the aminoーterminus of the signal peptide in Escherichia coli." J.Biol Chem.265. 8164-8169 (1990)
• [文献書誌] Tokuda,H.,Kim,Y.J.and Mizushima,S.: "In vitro protein translocation into inverted membrane vesicles prepared from Vibrio alginolyticus is stimulated by the electrochemical potential of Na^+ in the presence of Escherichia coli SecA." FEBS Letters. 264. 10-12 (1990)
• [文献書誌] Mizushima,S.and Tokuda,H.: "In vitro translocation of bacterial secretory proteins and energy requirements." J.Bioenerg.Biomemb.22. 389-399 (1990)
• [文献書誌] Matsuyama,S.,Akimaru,J.and Mizushima,S.: "SecEーdependent overproduction of SecY in Escherichia coli:Evidence for interaction between two components of the secretory machinery." FEBS Letters. 269. 96-100 (1990)
• [文献書誌] Shiozuka,K.,Tani,K.,Mizushima,S.and Tokuda,H.: "The proton motive force lowers the level of ATP required for the in vitro translocation of a secretory protein in Escherichia coli." J.Biol.Chem.265. 18843-18847 (1990)
• [文献書誌] Tani,K.,Tokuda,H.and Mizushima,S.: "Translocation of proOmpA possessing an intramolecular disulfide bridge into membrane vesicles of Escherichia coli:Effect of membrane energization." J.Biol.Chem.265. 17341-17347 (1990)
• [文献書誌] Tokuda,H.,Shiozuka,K.and Mizushima S.: "Reconstitution of translocation activity for secretory proteins from solubilized components of Escherichia coli." Eur.J.Biochem.192. 583-589 (1990)
• [文献書誌] Shinkai,A.,Akita,M.,Matsuyama,S.and Mizushima,S.: "Quantitative renaturation from a guanidineーdenatured state of the SecA dimer,a 200 kDa protein involved in protein secretion in Escherichia coli." Biochem.Biophys.Res.Commun.172. 1217-1223 (1990)
• [文献書誌] Yamane,K.,Akiyama,Y.,Ito,K.and Mizushima,S.: "A positively charged region is a determinant of the orientation of cytoplasmic membrane proteins in Escherichia coli." J.Biol.Chem.265. 21166-21171 (1990)