膜蛋白質SecYのポリペプチドトランスロケ-タ-機能の追求

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02404087
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 伊藤 維昭 京都大学, ウイルス研究所, 教授 (90027334)
• 研究分担者: 秋山 芳展 京都大学ウイルス研究所, 助手 (10192460)
• キーワード: タンパク質膜透過 / シグナルペプチド / SecY / 膜タンパク質 / プロテア-ゼ / 分泌 / HNS / サプレッサ-

研究概要

1.分泌タンパク質の膜透過中間体の検出.secY変異株を許容温度で標識,細胞分画を行い,シグナルペプチドが切断されているが膜透過は完了していない中間体分子の検出に成功した.それが成熟体とは異なる構造をしており,プロトン駆動力に依存して膜透過を起こすことを示した.膜透過の初期過程,後期過程を定義し,SecYが両方に関与することを明らかにした.
2.SecYの生化学的解析.細胞抽出液で,SecYがOmpTプロテア-ゼによる切断を受けることを見い出し,OmpT遺伝子欠損変異株のみを用いた試験管内膜透過反応系を構築した.
3.SecYの遺伝学的解析.低温感受性secY変異株の解析を行い,変異によるアミノ酸配列の変化を塩基配列解析で同定した.低温感受性変異株の一つ(secY39)では,表層タンパクの分泌機能が低温で障害を受け,従来研究された高温感受性secY変異株に比べて温度変化に対して迅速に応答することを示した.またこの変異株から調製した膜小胞が,試験管内膜透過反応においても低温感受性障害を持つことを示した.新たに多数の分泌欠損secY変異株を分離した.一方,高温感受性変異secY24に対するマルチコピ-サプレッサ-を系統的に分離し,熱ショックタンパク質HtpG,中性ヒストン様タンパク質HNS,新たに見い出された遺伝子msyBの産物の過剰生産が,それぞれsecY24変異による分泌欠損を回復させることを明らかにした.
以上の研究で超遠心機ロ-タ-は細胞分画に,冷凍庫と保冷庫は細胞,タンパク質,DNA保存に,分光光度計はDNA,タンパク質の定量,酵素活性の測定に,ク-ルブロックバスは試験管内膜透過反応に用いた.

研究成果

• [文献書誌] Akiyama,Y.and Ito,K.: "SecY protein,a membrane embedded secretion factor of E.coli,is cleaved by the OmpT protease in vitro." Biochem.Biophys.Res.Commun.167. 711-715 (1990)
• [文献書誌] Akiyama,Y.,Inada,T.,Nakamura,Y.and Ito,K.: "SecY,a multispanning membrane protein,contains a potential leader peptidase cleavage site." J.Bacteriol.172. 2888-2893 (1990)
• [文献書誌] Amaya,Y.,Nakano,A.,Ito,K.and Mori,M.: "Isolation of a yeast gene,SRH1,that encodes a homologue of the 54K subunit of mammalian signal recognition particle." J.Biochem.107. 457-463 (1990)
• [文献書誌] Baba,T.,Jacq,A.,Brickman,E.,Beckwith,J.,Taura,T.,Ueguchi,C.,Akiyama,Y.,and Ito,K.: "Characterization of coldーsensitive secY mutants of Escherichia coli." J.Bacteriol.172. 7005-7010 (1990)
• [文献書誌] Ito,K.: "Structure,function and biogenesis of SecY,an integral membrane protein involved in protein export." J.Bioenerg.Biomembr.22. 353-367 (1990)
• [文献書誌] Nakamura,K.,Takamatsu,H.,Akiyama,Y.,Ito,K.,and Yamane,K.: "Complementation of the protein transport defect of the Escherichia coli secY mutant (secY24) by B.subtilis secY homologue." FEBS Lett.273. 75-78 (1990)
• [文献書誌] Ueguchi,C.,and Ito,K.: "Escherichia coli sec mutants accumulate a processed immature form of maltoseーbinding protein (MBP),a lateーphase intermediate in MBP export." J.Bacteriol.172. 5643-5649 (1990)
• [文献書誌] Yamane,K.,Akiyama,Y.,Ito,K.,and Mizushima,S.: "A positively charged region is a determinant of the orientation of cytoplasmic membrane proteins in Escherichia coli." J.Biol.Chem.265. 21166-21171 (1990)
• [文献書誌] Ito,K.,Akiyama,Y.,Ueguchi,C.,Taura,T.,and Baba,T.(ed.M.Ikehara): "Structure and function of E.coli SecY protein,an integral membrane component of the protein translocation system.Protein Engineering.Protein Design in Basic Research,Medicine,and Industry" Japan Scientific Societies Press/SpringerーVerlag,6 (1990)