| 研究課題/領域番号 |
02453129
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
熊谷 英彦 京都大学, 農学部, 助教授 (70027192)
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| 研究分担者 |
矢野 俊博 京都大学, 農学部, 教務職員 (30135553)
鈴木 秀之 京都大学, 農学部, 助手 (10202136)
山本 憲二 京都大学, 農学部, 助手 (70109049)
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| キーワード | グルタチオン / γーグルタミルトランスペプチダ-ゼ / グルタチオンSートランスフェラ-ゼ / 大腸菌 / Issatchenkia orientalis / グルタチオン抱合 / クロ-ニング |
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| 研究概要 |
1.大腸菌γーグルタミルトランスペプチダ-ゼ(GGT)の遺伝子<ggt>___ーをプラスミドpKK223ー3に組み込み、これをGGT欠損大腸菌株にクロ-ニングした。本クロ-ニング株は20℃の培養でGGTを高発現するが、37℃では低い活性しか得られず、またIPTGによる誘導生成も見られなかった。これは、<ggt>___ーが有するプロモ-タ-部分の影響の結果と考えられ、この部分の除去に部位特異的変異による方法を適用中である。これとは別にGGTを大量に生産する目的で、大腸菌のペリプラスムタンパク漏出変異株に、<ggt>___ーを持つプラスミドを導入し、GGT漏出変異株を作成した。本株は、12mg/LのGGTを培地中に漏出し、この培地から、収率50%、150倍の精製でGGTの単一標品を得ることが出来た。
2.大腸菌からGGTを精製し、X線解析に適したGGT結晶の作成条件を検討しているが、未だに適当な結晶は得られていない。
3.<Issatchenkia orientalis>___ーからグルタチオンSートランスフェラ-ゼ(GST)のmRNAを精製し、そのcDNAのライブラリ-を大腸菌で作成、GST遺伝子のクロ-ニング株を得た。本大腸菌株が、GSTを高発現していることを活性測定及び免疫学的方法(Western blot)により確認した。またGSTの誘導生成が、転写レベルで行われていることを明らかにした。
4.<I.orientalis>___ーの細胞及び無細胞抽出液を用いて、ジニトロベンゼンのグルタチオン抱合体の代謝を進行せしめ、その産物を単離同定した。これをNMRやMSスペクトロメトリ-により、構造決定し、グルタチオン抱合体がシステイン包合体に分解されることを解明した。
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