| 研究課題/領域番号 |
02453129
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
熊谷 英彦 京都大学, 農学部, 教授 (70027192)
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| 研究分担者 |
矢野 俊博 京都大学, 農学部, 教務職員 (30135553)
鈴木 秀之 京都大学, 農学部, 助手 (10202136)
山本 憲二 京都大学, 農学部, 助教授 (70109049)
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| キーワード | グルタチオン / グルタチオンSートランスフェラ-ゼ / γーグルタミルトランスペプチダ-ゼ / γーグルタミルトランスフェラ-ゼ / 解毒 / Escherichia coli / Issatchenkia orientalis |
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| 研究概要 |
(1)E.colikー12は、低温(20℃)培養でγーグルタミルトランスペプチダ-ゼ(GGT)の高活性を示す。その機構を解明する目的で、野生株およびGGT遺伝子(ggt)のクロ-ニング株を20℃、37℃、42℃で培養し、ウエスタンおよびノザンブロッテングを行い、GGTの低温依存性発現が、転写段階で調節されているとの結論を得た。GGTの低温依存性発現はggtのプロモ-タ-部分の機能の結果と考えられ、この部分の除去及び高発現プロモ-タ-への置換を種々の方法で試みて来たがいまだに成功していない。
(2)活性中心と予測されるアミノ酸残基のひとつArg571を部位特異的によりAlaに変換したところ、変異GGTは活性を持たず、またプロセッシングを受けずにプロGGTのままでペリプラスムに局在していることが明らかになった。
(3)E.coliKー12からGGTを精製し、X線解析に適したGGT結晶の作成条件を検討し、2×0.2×0.2mmの棒状結晶、および2×1×0.2の板状結晶を得るに到っている。今後これらの結晶を用いて、X線解析を行っていく予定である。
(4)グルタチオン抱合体をさらに代謝分解する酵素として、金属依存性のカルボキシペプチダ-ゼ様酵素の関与を明らかにし、そのIssatchenkia orientalisからの精製、性質の解明を行っている。
(5)さきに調製したグルタチオンSートランスフェラ-ゼ(GST)のcDNAを、プラスミドpYM2のEcoRIサイトに挿入、この組換えベクタ-を用いて、S.cerevisiae/EH13ー15の形質転換を行った。得られた形質転換株は、GSTを発現し宿主株の約15倍の活性を示した。
(6)細胞分画および、凍結切片法一免疫電顕により本酵素がI.orientalis細胞の表層に局在することを確認した。
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