| 研究課題/領域番号 |
02453129
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・発酵学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
熊谷 英彦 京都大学, 農学部, 教授 (70027192)
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| 研究分担者 |
矢野 俊博 京都大学, 農学部, 教務職員 (30135553)
鈴木 秀之 京都大学, 農学部, 助手 (10202136)
山本 憲二 京都大学, 農学部, 助教授 (70109049)
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| 研究期間 (年度) |
1990 – 1991
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| キーワード | グルタチオン / グルタチオンSートランスフェラ-ゼ / γーグルタミルトランスペプチダ-ゼ / γーグルタミルトランスフェラ-ゼ / 解毒 / Escherichia coli / Issatchenkia orientalis |
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| 研究概要 |
(1)大腸菌γーグルタミルトランスペプチダ-ゼ(GGT)の遺伝子ggtをGGT欠損大腸菌にセルフクロ-ニングした。本クロ-ニング株は野生株同様20℃での培養でGGTを高発現し、37℃では低い活性しか示さなかった。ウエスタンおよびノザンブロッティングを行い、GGTの低温依存性発現が、プロセッシング段階ではなく転写段階で調節されているとの結論を得た。
(2)大腸菌のペリプラスムタンパク漏出株に、ggtをクロ-ニングし、GGT漏出変異株を作成、迅速大量精製を行った。
(3)X線解析に適したGGT結晶の作成条件を検討し、長さ2mmの棒状結晶および板状結晶を得た。
(4)Arg571をAlaに変えた変異GGTは活性を示さず、プロGGTのままでペリプラスムに局在することを明らかにした。
(5)酵母Issatchenkia orientalisからグルタチオンSートランスフェラ-ゼ(GST)のmRNAを精製し、GSTcDNA遺伝子を大腸菌にクロ-ニングし、この株がGSTを高発現していることを確認、さらにGSTcDNAのヌクレオチド配列を明らかにした。またGSTの誘導生成が、転写レベルで行われていることを明らかにした。
(6)I.orientalisのグルタチオン抱合体代謝経路について検討し、システイン抱合体にまで分解されることを解明した。この代謝にカルボキシペプチダ-ゼ様酵素が関与することを明らかにした。
(7)I.orientalis GSTcDNAを用いて組換えベクタ-を作成、S.cerevisiaeの形質転換を行い、宿主株の約15倍のGST活性を示す転換株を得た。
(8)細胞分画および、凍結切片・免疫電顕法によりI.orientalisGSTがその細胞の表層に局在することを確認した。
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