アカパンカビのATPーGTP結合蛋白質を含む信号伝達系遺伝子の解析

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02454002
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 蓮沼 仰嗣 横浜市立大学, 木原生物学研究所, 教授 (80012475)
• キーワード: ATPーGTPー結合蛋白質 / 内存性ADPーリボシル化酵素 / 膜分画及び可溶性分画 / UVークロスリンキング / Haーras抗体 / ras関連遺伝子のクロ-ニング / パルスフィ-ルド電気泳動 / クロ-ン化DNAのマッピング

研究概要

a)アカパンカビの菌糸より膜を含む粗抽出液を調製した。1%ルブロ-ルで処理後、ゲル濾過で分子量により分画した。得られたAGN1〜6分画はおよそ30種の( ^<35>S)ATPγS,( ^<35>S)GTPγSを結合するATPーGTPー結合蛋白質が見い出された。その内12種類が内在性ADPーリボシル化酵素によりADPーリボシル化された。
b)アカパンカビ菌糸から0.25M蔗糖存在下に膜分画及び可溶性分画を調製した。(αー ^<32>P)ATP,(αー ^<32>P)GTPを結合後UV照射をし、これらの結合蛋白質にクロスリンクさせた。その試料をSDSーPAGEで分画し、オ-トラジオグラフィをとった。およそ90%の結合蛋白質が(αー ^<32>P)ATPおよび(αー ^<32>P)GTPを結合した。抗Haーras抗体を用いてウェスタンブロットすると23KDに濃いバンドと他に数本のバンドが得られた。これらに対応して、(αー ^<32>P)ATPおよび(αー ^<32>P)GTP結合活性を認めることができた。
c)Haー<ras>___ーDNAをプロ-ブとしてゲノムDNAバンクより<ras>___ー関連遺伝子をクロ-ニングした。ヌクレオチド配列の決定により、イントロンの存在が明かとなった。N末端の近傍にATPー結合の共通配列GlyXGlyXXGlyを見い出した。Altschulerら(1990)によりクロ-ンされた<ras>___ー関連遺伝子はcDNAクロ-ンで、24KDと計算された。これもATPー結合の共通配列を含み上記23KD蛋白質との関連が考えられる。
d)アカパンカビ膜分画にサイクリックフォスフォジエステラ-ゼを見い出した。この酵素は10mM MgCl_2存在下に、0.1mM GTPにより活性化され、0.5mM ATPにより活性が抑制された。光信号はATPーGTPー結合蛋白質を経由してこの酵素の活性制御する可能性がある。
e)アカパンカビの核を調製し、NotIでDNAを切断後、パルスフィ-ルド電気泳動法によりDNAを分画した。各DNA断片を既にクロ-ンされた遺伝子を用いてその染色体上の位置を決定しつつある。

研究成果

• [文献書誌] Hasunuma,K.: "Molecular mechanism of light signal perception in plants and fungi." Trends in Photochem.Photobiol.(1991)
• [文献書誌] Hasunuma,K.: "Nucleoside triphosphate (NTP)ーbinding proteins and endogenous ADPーribosyl transferase in <Neurospora>___ー <crassa>___ー." Plant & Cell Physiol.(1991)
• [文献書誌] Hasunuma,K.,Asai,H.and Imaseki,H.: "Nucleoside triphosphate (NTP)ーbinding proteins in the plumule of etiolated mung bean seedlings." Plant & Cell Physiol.
• [文献書誌] Hasunuma,K.and Briggs,W.R.: "Light signal is transduced to ATPーGTPーbinding proteins in etiolated pea seedlings." Nature in preparation.
• [文献書誌] Hasunuma,K.and Fujita,Y.: "ATPーGTP(NTP)ーbinding proteins crossーreacting to antiー<ras>___ー antibody in the mycelia of <Neurospora>___ー <crassa>___ー." J.Biol.Chem.in preparation.
• [文献書誌] Hasunuma,K.: "Molecular mechanism of light signal transduction and circadian rhythm in plants." Gordon Research Conference on Chronobiology,Irsee,Germany 1991,invited.
• [文献書誌] Hasunuma,K.and Briggs,W.R.: "Light signal transduction in etiolated pea seedlings." Ist Annual Meeting of Japanese Society of Comparative Physiological Biochemistry,Abstr.(1990)
• [文献書誌] Hasunuma,K.: "ATPーGTP(NTP)ーbinding proteins and light signal transduction in <Neurospora>___ー <crassa>___ー." XVIth Fungal Genet.Conf.Asilomar,USA.(1991)
• [文献書誌] Yoshida,S.,Kanaーuchi,A.,Hasunuma,K.and Murayama,T.: "Cloning and sequencing of a <Neurospora>___ー <ras>___ー gene." XVIth Fungal Genet.Conf.Asilomar,USA.(1991)
• [文献書誌] Hasunuma,K.: "ATPーGTP(NTP)ーbinding proteins and molecular mechanism of light signal transduction in plant and fungus." JapanーChina Joint Seminar on Biophysics.Xiーan,china.(1991)
• [文献書誌] Hasunuma,K.: "ATPーGTPーbinding proteins and light signal transduction in plant and fungus." IInd JapanーSoviet Union Symposium;Receptor:Structure and Function.(1991)
• [文献書誌] 蓮沼 仰嗣: "遺伝44巻1号" 特集;植物細胞で信号はどう伝わるか.特集へのアプロ-チ, 10 (1990)
• [文献書誌] 蓮沼 仰嗣: "遺伝44巻1号" 細胞内信号伝達のあらまし, 11-15 (1990)
• [文献書誌] 蓮沼 仰嗣: "遺伝44巻1号" 植物の光信号受容とATPーGTP結合蛋白質, 50-57 (1990)
• [文献書誌] 蓮沼 仰嗣: "横浜市立大学論叢、自然科学系列42巻2号" 植物の光信号伝達と概日性リズム, (1991)