|
木質系バイオマスの変換による高度利用技術の開発のため、カワラタケ・ラッカ-ゼ遺伝子の解析と、新生物による生物的脱リグニン化技術に必須の組換え体作出のため、外来遺伝子導入実験を行った。
カワラタケ・ラッカ-ゼ遺伝子については、この遺伝子のcDNA断片をプロ-ブにして、カワラタケの遺伝子ライブラリ-から候補遺伝子を釣り上げることに成功し、2種類のクロモソ-マルDNA断片を得た。これより遺伝子の構造分析を行い、制限酵素地図、イントロンの数、部分的な塩基配列の決定に成功した。
組換え体作出のための実験では、カワラタケを細胞壁溶解酵素(ノボザイム、セルラ-ゼ)で処理し、プロトプラストを得ることに成功した。このプロトプラストを精製し、ポリエチレングリコ-ルと塩化カルシウムで処理してプラスミド(pHN134)を導入した。このプラスミドはカナマイシン耐性遺伝子を含むものである。
形質転換体プロトプラストは25mg/l濃度のG418存在下で再生され、未転換体では再生することが出来なかった。結局、形質転換体のスクリ-ニング法が確立されたといえる。この条件下での形質転換体の再生率は5×10^4個あたり1.9×10^3個であり、3.8%であった。
さらに、形質転換体として選抜されたあ418耐性株に対して、外来遺伝子が導入されているかどうかを確かめるため、PCR法を用いてG418耐性遺伝子を増幅し、電気泳動実験により増幅遺伝子の検出を行った。この結果、574bpの増幅断片は野生株では見られず、2種の組換え体で明らかに検出された。このことはプラスミドpHN134がカワラタケに導入されたことを意味し、従ってカワラタケに外来遺伝子を導入することに成功したことになる。
|
