クラッベ病における欠損酵素のクロ-ニング・遺伝子異常の解析と遺伝子治療の試み

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02454270
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 岡田 伸太郎 大阪大学, 医学部, 教授 (30028609)
• 研究分担者: 塚本 浩子 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 ; 谷池 雅子 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 ; 福島 久雄 大阪大学, 医学部, 助手 (70199214) ; 乾 幸治 大阪大学, 医学部, 助手 (90175208)
• キーワード: クラッベ病 / ガラクトシルセラミダ-ゼ

研究概要

当初、正常人胎盤を材料としてGalactocerebrosidaseの抽出法を確立したが、正常人白血球の入手が可能となったため、以後白血球から分離精製を行った。
一回量約500gの白血球沈さをリン酸緩衝液とともにミキサ-でhomogenateし、1%のSodium Taurocholate(TC)を界面活性剤として用い1%濃度にて一晩撹拌して抽出した。遠心上清をTC濃度0.4%としOctylーSepharose(700ml)カラムにアプライし4%Sodium Taurocholateで溶出した。次に活性分画をConAーSepharose(30ml)カラムにアプライし0ー0.5M MgCl_2.0ー0.8M αーmethyl mannopyranosideのgradient elutionをおこない、さらに酵素分画をPhenylーSepharose(20ml)カラムにアプライし、Sodium Taurocholate 1ー10%のgradient elutionを行い酵素活性を指標に精製した。PhenylーSepharose(2ml)にて濃縮後、高速液体クロマトグラフィ-装置でゲル瀘過カラム(東洋ソ-ダSWP)を用いて精製した。
精製した蛋白はゲル瀘過では分子量約10万、SDS電気泳動にて分子量約9万のバンドを認めた。
現在までに総重量5100gの白血球を処理し、Galactocerebrosidaseを蛋白量として約500ー600μg、比活性として58000nmol/h/mg.proteinの蛋白を得た。
これはGalactocerebrosidaseのモノクロ-ナル抗体の作成とアミノ酸配列決定に足ると思われるので、これを用いてモノクロナ-ル抗体の作成中である。

研究成果

• [文献書誌] Yoda K: "Lysosulfatide(Sulfogalactosyl sphingosine)accumulation in tissues from patients with metachromatic Teulcodystrophy" J.Neurodrem. 55. 1585-1591 (1990)
• [文献書誌] Inui K: "Study of pathogenesis in twitcher mouse,an enzymatically authentic model of Krabbe's clisease" J Neurol Sci. 100. 124-130 (1990)
• [文献書誌] Inui K: "A case of chronic GM_1 gangliosidosis preseriling as dystonia:clinical and biochemical studies" J Neuro'gy. 237. 491-493 (1990)
• [文献書誌] Taniike M: "Ultrasmictural pathology of rectum and skin biopsy specimens in lysosomal storage disease" Acta Histochem Cytochem. 23. 81-92 (1990)
• [文献書誌] Yamashita K: "Characteristics of asparagineーlinked sugar chains of sphingolipid actlvator protein I purified from normal liver asat GM_1 gangliosidosis(type1) liver" BiochemistryーUSA. 29. 3030-3039 (1990)
• [文献書誌] Miclorikawa M: "Uptake and metabolism of rokliolabeled GM_1 ganglioside in skinfibroblasts from confrels and patients with GM_1 gangliocidocis" J Inher Metab Dis.