| 研究課題/領域番号 |
02454270
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
岡田 伸太郎 大阪大学, 医学部, 教授 (30028609)
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| 研究分担者 |
福島 久雄 大阪大学, 医学部, 助手 (70199214)
乾 幸治 大阪大学, 医学部, 講師 (90175208)
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| キーワード | ガラクトセレブロシダーゼ / クローニング / クラッベ病 |
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| 研究概要 |
クラッベ病の欠損酵素であるgalactocerebrosiraseのクローニングをめざし、平成3年度に精製酵素を用い常法にてモノクローナル抗体を作成した。得られたLgG1クラスのモノクローナル抗体1-9-1-9にて発現ベクターλgt11のヒト胎盤由来のcDNAライブラリーをスクリーニングしたが有意のpositive cloneを得る事が出来なかった。
そこで精製酵素のアミノ酸配列からオリゴヌクレオナドを合成しこれをブローブとしてcDNAライブラリーのスクリーニングを計画した。精製酵素をSDS-PAGEで分離した分子量約10万のバンドをPVDF膜に転与しN端のアミノ酸配列を気相シークエンサーにて求めたところ最高でアミノ酸14残基まで解続できた。このN端アミノ酸配列より予想されるいくつかのオリゴマーを合成し、これをブローブとして上記のλgt11のcDNAライブラリーをスクリーニング中である。またアミノ酸の内部配列を調べるため、PVDF膜に転写後の蛋白を膜上で酵素消化しペプチドマッピングをとり、得られたペプチドのアミノ酸情報を現在解析中である。
一方精製酵素の生化学的性質について調べたところ、至適pHはlaurocholate系では4.2、Chplate系では4.6であり比活性は各々1.48×10^5nmol/hr/mg、2.30×10^5nmol/hr/mgであった。Lineweaver-BurkフロットよりTaurocholate系でVmax=1.54×10^5nmol/hr/mg、Km=5-10βMともとまった。また本酵素の天然基質とGM1ganglioside、人工蛍光基質6-he|aι|eιano|am|no-4-methy|umbe|lifery|-β-ga|actopvranos|deの阻害実験により後2者は競合阻害を示すことが判明した。
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