| 研究概要 |
1.新しいHPLCシステムを用いた3βーOH胆汁酸標準試料の分離定量法の確立:新たに本研究費補助金で購入したβーHSD(Hydroxysteroid dehydrogenase)固定化酸素カラムを装備したJASCO,800HPLCシステムを用いてポストカラム法にて,標準試料として3βーhydroxyー5ーcholenoic acid(3βーOHー△^5:Free,Glycine抱合・Taurine抱合.各1nmol/10μl),3β,7βーdihydroxycholanoic acid(3βーUDCA:Free,Glycine抱合・Taurine抱合.各1nmol/10μl)および内部標準として5βーandrostaneー3β,17βーdiol(1nmol/10μl)の計7種のHPLC分離条件を世界で初めて得た。すなわち,そのHPLC条件は,ASTEC社のCYCLOBONDーI(250×4.6mm)分離カラムを装着したHPLCに移動相A:CH_3OH/20mM NH_4 Phosphate(pH7.0)=40/60,B:CH_3OH/20mM NH_4 Phosphate(pH7.0)=60/40,A/B(100/0)→A/B(0/100)のlinear gradient 50min,カラム温度48℃,流速1ml/minとし,この分離後に反応液0.6mM NAD^++20mM KH_2PO_4+1mM EDTA+0.05%2ーmercaptoethanolを流速2ml/minで流す方法である.2.念のため3αーOH胆汁酸の標準試料15種を流してすべてpeakが出現しないことを確認することによって,βーHSD固定化酵素の酵素特異性を確認できた.3.当初入手した各種3βーOH胆汁酸を一斉にHPLCで測定すると,GlycineおよびTaurine抱合体が分離されなかったため,溶離液A液・B液ともに,βーcyclodextrine 2mMを加える方法に改良し,各抱合体の分離が確実となった.しかし,βーcyclodextrineによる抱接作用のため感度が極端に低下した.そこで,βーcyclodextrine吸着分離用カラム(CyclobondーI)を用いることによりこの問題を解決することができた。以上の成果をふまえて,現在,臨床例特に閉塞性黄疸および肝硬変について減黄効果および手術時における肝予備能としての3βーOHの胆汁酸の測定の意義について来年度にさらに詳細に検討を行う予定である.
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