| 研究概要 |
[目的]牛のtissue inhibitor of metallopsoteinase(bーTIMP)遺伝子及びmetallopsiteinase inhibitor(bーMI)遺伝子の先導塩基配列(leader sequence)より上流のプロモ-タ-領域の塩基配列を決定すること。
[実施計画]1、ゲノムDNAを鋳型として,PCR法を用いてbーTIMP遺伝子を直接クロ-ニングすることを試みた。鋳型としては高分子子牛胸腺DNAを,又プライマ-としては既に報告されている人のTIMP遺伝子に基づいて合成した5'末端から第136ー156番の排列と等しい並びに第640ー681番の排列と相補的な塩基排列の2種のオリゴ・デオキシヌクレオタイドを用いた。牛と人との遺伝子の若干の相違を予想して,PCRを行う場合のアンニ-リングの条件をゆるくした。PCR産物として,上記プライマ-相互間の距離と一致する約500塩基対のDNA断片を得ており,その構造を解析中である。
2、Inverse PCR法により,目的のbーMIのプロモ-タ付近のDNA断片のクロ-ニングを試みた。鋳型DNAとしては高分子子牛胸腺DNAを制限酵素EcoRIで消化したものを用いた。プライマ-としては,己に報告されているbーMIの第387ー416番の塩基排列に相補的な及び第900ー920番の塩基排列に等しいオリゴデオキシヌクレオチドを用いた。EcoーRI消化DNAをT_4ーDNAリガ-ゼで環状化したものを鋳型としてPCR法で増幅した。その結果,約1100塩基対の増幅産物が認められた。このDNA産物について種々検討中である。
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