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Achromobacterプロテア-ゼIはAchromobacter lyticusが産生する分泌性セリンプロテア-ゼでLysーPro結合を含むリジル結合のみ特異的に切断する。我々はAPIのリジンに対する厳密な基質特異性の構造基盤の解析とタンパク質工学的方法によるAPIの基質特異性の改変を試みた。
トリプシン系セリンプロテア-ゼとのアミノ酸配列比較より、APIの2つの酸性アミノ酸、Glu190とAsp225が基質特異性決定基である可能性が示唆された。どちらの残基がリジン特異性に関与しているかを決定するため、Glu190とAsp225の変異体を作製した。Glu190をAap、Gln、Leuに置換した変異体はすべて成熟体として大腸菌のペリプラズムに発現した。これら3種類の変異体の基質特異性と触媒活性は野性型とほぼ同じであった。一方、Asp225もGlu、Asn、Leuにそれぞれ置換したところ、Gluへの置換体のみ活性な成熟体として発現したが、活性低下は著しかった。他の2つの変異体は活性をもたないプロ体の形でペリプラズムに蓄積した。以上の結果は、Asp225がAPIのリジル結合水解活性に必須であることを示唆している。
最近、APIの立体構造がX線解析により明らかになった。APIとトリプシンの立体構造は全体的に類似し、特に触媒部位週辺で相同性が高い。しかし、S1ポケットでは大きな相違が見られAPIのポケットはトリプシンより約2Å浅くなっている。これはAsp225の側鎖がポケットの内側に突き出しているためである。この浅さのため、ArgはAPIのS1ポケットに結合できないと考えられた。そこでAsp225とVal188をGlyとAspにそれぞれ置換することでポケットの底を深くし、APIの基質特異性をアルギニンに変換する試みを行なった。しかし、得られた変異体は大腸菌でプロ体でも成熟体でも発現しなかった。この原因は現在のところ不明である。
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