無脊椎動物の体液凝固機構の解明

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02454539
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 岩永 貞昭 九州大学, 理学部, 教授 (90029942)
• 研究分担者: 太和田 勝久 九州大学, 理学部, 助教授 (20029507) ; 川畑 俊一郎 九州大学, 理学部, 助手 (90183037)
• キーワード: カブトガニ血球細胞 / G因子 / セリンプロテア-ゼ / βー1,3ーグルカン / 体液凝固因子 / 無脊椎動物 / cDNAクロ-ニング / 真菌類

研究概要

カブトガニの血球内には、β(1→3)ーDーグルカンによって惹起される凝固系も存在し、Proclotting enzymeの活性化を介してゲルを形成する。β(1→3)ーDーグルカンは真菌類の細胞壁の主要な構成成分であり、この凝固系もカブトガニの異物排除機講において重要である。
本年度、我々はβ(1→3)ーDーグルカン感受性プロテア-ゼチモ-ゲン(G因子と命名)を血球抽出液から精製するとともに、G因子前駆体の活性化に伴う構造変化及びそのcDNAクロ-ニングを行った。
G因子の活性は、Dーグルカンの共存下で発現するアミダ-ゼ活性を直接蛍光性ペプチド基質で測定した。先ず、血球抽出液をDextran Sul=fateーSepharose CLー6Bカラムにかけ、他の凝固因子と分別し、次いでG因子画分をCon AーSepharose→SephacrylーS200→MonoーSカラムに順次かけつつ、その前駆体の精製を進めた。血球抽出液中でのG因子の含量は、他の凝固因子に比べて極端に少なく、未だ高純度標品を得るに至ってないものの、SDSーPAGE上でのG因子の検出は可能であった。精製G因子は、還元及び非還元条件下のSDSーPAGEにおいて、72kDaと37kDaに相当する2本のバンドを示した。また、非還元条件下での72kDaと37kDaのバンドは、1μg/m1のβーグルカンによる活性化に伴い、共に消失し新たに55KDaと34KDa、17KDaの断片が出現した。従って、G因子は72kDaと37kDaの二つのサブユニットから成るプロテア-ゲチモ-ゲンと推定され、βーグルカンの存在下で、両サブユニット内に限定水解が起き活性型プロテア-ゼに変換すると考えられる。目下、このプロテア-ゼの全構造を明らかにする目的で、cDNAクロ-ニングを試みつつある。

研究成果

• [文献書誌] Toh,Y.,et at.: "Structure of Hemocytes of the Japanese Horseshoe Crab Tachypleus tridentatus:Fine Structure,Morphological Changes During Coagulation and Localization of Clotting Factors and Antimicrobial Substances." Cell and tissue Research. 266. 137-147 (1991)
• [文献書誌] Muta,T.,et al.: "Limulus Clotting Factor(Factor C):A Novel protease that has a Mosaic Structure with Complementーlike and Lectinーlike Domains." J.Biol.Chem.266. 6554-6561 (1991)
• [文献書誌] Tokunaga,F.,et at.: "Purification and Characterizationof Lipoplysaccharidesensitive Serine Protease Zymogen(factor C)Isolated from Limulus polyphemus Hemocytes:A NEWLY IDENTIFIES INTRACELLULAR ZYMOGEN ACTIVATED BY αーCHYMOTRYPSIN,NOT BY TRYPSIN." J.Biochem.109. 150-157 (1991)
• [文献書誌] Yae,Y.,et al.: "Isolation and Characterization of “Thermolabile Substance"or“Hakata Antigen"Detercted by Precipitating(auto) Antibody in Sera of Patients with Systemic Lupua Erythematosus." Biochem.Biophys.Acta. 1078. 369-376 (1991)
• [文献書誌] Miyata,T.,et al.: "Factor IX Amagasaki:A New Mutation in the Catalytic Domain Resulting in the Loss of Both Coagulant and Esterase Activities." Biochemistry. 30. 11286-11291 (1991)
• [文献書誌] Murakami,T.,et at.: "Direct Virus Inactivation of Tachyplesin I and Its Isopeptides from Horseshoe Crab Hemocytes." Chemotherapy. 37. 327-334 (1991)
• [文献書誌] 宮田 敏行,岩永 貞昭: "注目の臨床実験検査法99ー112頁(共著)" 中山書店, 13 (1991)
• [文献書誌] Miyata,T.and Iwanaga,S.: "Recent Advances in Thrombosis and Fibrinolysis (ed.by Kenzo Tanaka)" Academic Press,Inc.,New York, 13 (1991)