モノクロ-ナル抗体を利用した体液プロテア-ゼ活性測定法の開発と実用化

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02557016
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 岩永 貞昭 九州大学, 理学部, 教授 (90029942)
• 研究分担者: 木村 晧俊 (株)ペプチド研究所, 研究部長 (30072771) ; 宮田 敏行 九州大学, 理学部, 助手 (90183970)
• キーワード: 血液凝固VII因子 / 組織因子 / 合成ペプチド基質 / 外因系凝固反応 / γーGlaドメイン / 体液プロテア-ゼ

研究概要

血液凝固VII a因子(VII a)は、Ca^<2+>、リン脂質存在下で、組織因子(TF)と分子複合体を形成しつつ、外因系凝固反応を開始させる。分子レベルでのVII aとTFとの相互作用については、未だ殆ど不明のままであるが、その理由のひとつは、VII aーTF複合体の活性を直接測定できる適当な合成基質がないからである。1978年、Nemersonらは、VII aによるZーArgーpーnitro benzyl ester(ONb)水解を見い出し、pHスタットを用いた測定法を考案した(J.B.C.(1978)<253>___ー,2203ー2209)。本年度、我々はZーArgーONbに加えて、新しいBocーLeuーThrーArgーONb基質を合成するとともに、逆相HPLCを組合わせたVII a因子の高感度測定法を開発した。その原理は、未分解の基質と水解によって生成するpーnitrobenzyl alcoholを、オ-トサンプラ-と直結した0.1%TFAー45%CH_3CN(isocratic)系のCosmosil_3C_<18>(4.6×50mm)カラムを用いて分別することにあり、基質の水解量は、280nmでのpーnitro benzyl alcoholのpeak heightから測定した。この方法を用いてVII a測定の反応条件を検討した結果、VII a因子によるこれら合成基質の水解は、TFの存在下で著しく促進されることが明らかとなり、Nemersonらがかつてエステル基質の水解にTFは要求されないとした報告とは異なった。すなわち、VII aとTFの存在する反応系では、TF不在の系に比べて、VII aの合成基質水解能が約30倍高まった。一方、γーGlaドメインを除去したVII aでは、エステラ-ゼ活性そのものはintact VII aのそれと同じであるものの、TFによりエステラ-ゼ活性増強効果は消失した。従って、VII aとTFとの分子間相互作用にγーGlaドメインの関与する可能性が強く示唆される。
また、本年度、上記の研究に加えて、VII因子とTFのモノクロ-ナル抗体を作製するとともに、それらを用いた新しい体液プロテア-ゼの活性測定法についても検討した。未だ公表できる段階に達してないが、次年度完成を目標に研究を進めつつある。

研究成果

• [文献書誌] Sueyoshi T.et al.: "Cysteine Proteinase Inhibitor in the Ascitic Fluid of Sarcoma 180 Tumorーbearing Mice is a LowーMolecularーWeight Kininogen:Partial COOHーterminal Sequence and Susceptibility to Various Glandular Kallikrein." J.Biol.Chem.265. 10030-10035 (1990)
• [文献書誌] Hase,S.et al.: "Structure of (Xyl)_2GlcーOーSerー53 Found in the First Epidermal Growth Factorーlike Domain of Bovine Blood Clotting Factor IX." J.Biol.Chem.265. 1858-1861 (1990)
• [文献書誌] Takeya,H.et al.: "The Complete Amino Acid Sequence of the High Molecular Mass Hemorrhagic Protein,HR1B,Isolated from the Venom of <Trimeresurus>___ー <flavoviridis>___ー." J.Biol.Chem.265. 16068-16073 (1990)
• [文献書誌] Kawano,K.et.al.: "Antimicrobial Peptide,Tachyplesin I,Isolated from Hemocytes of the Horseshoe Crab (<Tachypleus>___ー <tridentatus>___ー):NMR Determination of the βーsheet Structure." J.Biol.Chem.265. 15365-15367 (1990)
• [文献書誌] Shigenaga,T.et al.: "Antimicrobial Tachyplesin Peptide Precursor:cDNA CLONING AND CELLULAR LOCALIZATION IN HORSESHOE CRAB (<Tachypleus>___ー <tridentatus>___ー)." J.Biol.Chem.265. 21350-21354 (1990)
• [文献書誌] Takeya,H.et al.: "Primary Structure of a Hemorrhagic Metalloproteinase,HTー2,Isolated from the Venom of <Crotalus>___ー <ruber>___ー <ruber>___ー." J.Biochem.108. 711-719 (1990)
• [文献書誌] 宮田 敏行,岩永 貞昭: "研究実験講座XIII臨床検査法の最前線II.6,凝固因子の分子異常症の検出" 中山書店(代謝27巻,第6号), 14 (1990)
• [文献書誌] 西村 仁,岩永 貞昭: "臨床科学8,内皮細胞シリ-ズ,26巻第3号" 世界保健通信社, 7 (1990)