モノクロ-ナル抗体を利用した体液プロテア-ゼ活性測定法の開発と実用化

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02557016
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 岩永 貞昭 九州大学, 理学部, 教授 (90029942)
• 研究分担者: 木村 皓俊 (株)ペプチド研究所, 研究部長 (30072771) ; 川畑 俊一郎 九州大学, 理学部, 助手 (90183037)
• キーワード: VII因子 / 組織因子 / 蛍光性ペプチド基質 / モノクロ-ナル抗体 / 体液プロテア-ゼ / エステラ-ゼ / IX因子 / X因子

研究概要

VIIa因子の高感度活性測定法の開発:VIIa因子はCa^2及びリン脂質存在下で、組織因子(TF)と分子複合体を形成し、天然基質であるIX因子ないしX因子を活性化する。分子レベルでVIIa因子とTFの相互作用については、まだ殆ど解明されてないが、その理由のひとつは、VIIa-TF複合体の活性を直接測定できる適当な合成基質がないからである。そこで、我々はZ-Arg-p-nitrobenzyl ester(ONb)基質の水解を高感度で定量する方法を検討するとともに、新しいペプチド基質の開発を試みた。また、この測定法を用いてVIIa因子のエステラ-ゼ活性に及ぼすTFの影響を調べた。VIIa因子の活性測定法は、未分解の基質(Z-Arg-ONb)と水解によって生成するp-nitrobenzyl alcoholを、オ-トサンプラ-と直結した0.1%TFA-45%CH_3CN(isocratic)系のCosmosil3C18(2.6×50mm)カラムを用いた逆相HPLCにより分離し、基質の水解量は280nmでのp-nitrobenzyl alcoholのpeak heightから定量した。
先ず、VIIaのエステラ-ゼ活性測定の反応条件を調べた結果、VIIa因子によるこれら基質の水解は、TF濃度依存的に促進されることが明らかとなった。この結果は、かつてNemersonらがVIIa因子のエステル基質水解は、TFの存在下で影響されないという報告と異なった。また、このTFによるVIIa因子のエステラ-ゼ活性増強効果は、ウシ脳から精製したTF及びヒトのreTFでも再現できた。IXa因子及びXa因子も、これらエステル基質に対して水解活性を示すが、TFによる活性の増強効果はなかった。従って、TFによるエステラ-ゼ活性の増強効果は、VIIa因子特有のものと考えられた。以上の結果は、TFがVIIaのセリンプロテア-ゼ領域と結合する可能性を示唆する。一方、VIIa因子の活性測定に使える各種のペプチドMCA基質70種余りを合成して調べた結果、Boc-Leu-Thr-Arg-MCAなど2種の特異基質を見い出した。

研究成果

• [文献書誌] Morita,T.,et al.: "γ-Carboxyglutamic Acid (Gla)-Domainless Blood Coagulation Factor IXa Species:Preparation and Properties." J.Biochem.110. 990-996 (1991)
• [文献書誌] Miyata,T.,et al.: "Factor IX Amagasaki:A New Mutation in the Catalytic Domain Resulting in the Loss of Both Coagulant and Esterase Activities." Biochemistry. 30. 11286-11291 (1991)
• [文献書誌] Muta,T.,et al.: "Limulus Clotting Factor (Factor C):A New Protease that has a Mosaic Structure with Complement-like and Lectin-like Domains." J.Biol.Chem.266. 6554-6561 (1991)
• [文献書誌] Suehiro,K.,et al.: "Blood Clotting Factor IX Nagoya 3:The Molecular Defect of Zymogen Activation Caused by an Arginine-145 to Histidine Substitution." Thrombosis Res.60. 311-320 (1991)
• [文献書誌] Tokunaga,F.,et al.: "Purification and Characterization of Lipoplysaccharide-sensitive Serine Protease Zymogen (factor C)Isolated from Limulus polyphemus Hemocytes:A NEWLY IDENTIFIED INTRACELLULAR ZYMOGEN ACTIVATED BY α-CHYMOTRYPSIN,NOT BY TRYPSIN." J.Biochem.109. 150-157 (1991)
• [文献書誌] Toh,Y.,et al.: "Structure of Hemocytes of the Japanese Horseshoe Crab Tachypleus tridentatus:Fine Structure,Morphological Changes During Coagulation and Localization of Clotting Factors and Antimicrobial Substances." Cell and Tissue Research. 266. 137-147 (1991)
• [文献書誌] Miyata,T.and Iwanaga,S.: "Recent Advances in Thrombosis and Fibrinolysis(ed.by Kenzo Tanaka)" Academic Press,Inc.,New York, 13 (1991)
• [文献書誌] 宮田 敏行.岩永 貞昭: "注目の臨床実験検査法.99-112頁" 中山書店, 13 (1991)