1992 年度実績報告書

ヒトcDNAバンクの全カタログ化をめざした新しいベクターシステムの開発と応用

研究課題

研究課題/領域番号	02557098
研究機関	大阪大学
研究代表者	野島博大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (30156195)
研究分担者	井上浩明東洋紡生化学研究所, 研究員小野泰子大阪大学, 微生物病研究所, 文部技官 (70194602) 岡崎孝映大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (70213923)
キーワード	コンピタントセル / エレクトロポレーション / cDNA / ライブラリー / ベクター / PCR法 / 平均鎖長 / ベクタープライマー
研究概要	本年度はこれまでに作製してきたベクターを用い実際に高品質のcDNAライブラリーを作製してきた。まず作製にあたり、従来本研究の初年度において我々が開発してきたコンピタントセルを用いてcDNAライブラリーを作製するよりエレクトロポレーション法による方がよりサイズの長いプラスシドDNAが取り込まれることを本年度に見い出した。ところがライゲース混液はこの方法には不適であり、エタノール沈澱などの処理も有効でない。そこで我々は、熱変性・フェノール処理・フィルター処通を行うことでこの困難を克服しうることを見い出し、これによって〜10^<10>ctu/pBR322の高効率をそのまま利用しうることが可能となった。 cDNAライブラリー作製法は2つの方法論を改善した。ひとつは我々が“自己閉環法"と呼んでいるもので、ベクタープライマーにCテイルを施し、その後BstXIで切断してG_4を突出させて、そのまま閉環する方法である。ベクターのマルチクローニングサイトを有効に利用し、フィルター処理をうまく用いることによって簡便、迅速に高品質のcDNAライブラリーが作製できるようになった。たとえば5μgのmRNAからスタートして平均鎖長1〜2Kbの1.2x^<106>〜4.8x^<107>ctuの独立クローンを持つcDNAライブラリーを作製できた。我々がリンカープライマー法と呼んでいる方法はもっと効率が良い。これはGubler-Hothman法を改善したものであるが、彼らの方法の欠点はほぼ解消してある。この方法を用い作製したcDNAライブラリーは、1μg相当のmRNAについて平均鎮長約1.8Kbの6.2x^<107>ctuの独立クローンを持つ。また1種のcDNAインサートを何種類ものベクターに簡略に入れられるのも便利な点である。この効率は20ng程度のpoly(A)^+RNAから100万個の独立クローンを持つcDNAライブラリーをPCR法を介さずに作製できることをまし、その可能性が広がったと思う。

研究成果

(5件)

すべてその他

すべて文献書誌 (5件)

[文献書誌] Kizaka-Kondoh S,Sato K,Tamura K,Nojima H,& Okkayama H.: "Raf-l protein kinase is an integral component of oncogenic signal cascade shared by epidermal growth factor and platelet-derived growth factor." Molecular Cellular Biology. 12. 5078-5086 (1992)
[文献書誌] Tatsuka M,Mitui H,Wada M,Nagata A,Nojima H,& Okayama H.: "Elongation factor-alfa is a transformation-susceptibilety determinant in BALB/c 3T3 cells." Nature. 359. 333-336 (1992)
[文献書誌] Tanaka K,Okazaki K,Okazaki N,Ueda T,Sugiyama A,Nojima H,& Okayama H.: "A new cdc gene required for S phase entry of Schizosaccharomyces pombe encodes a protein similar to the cdc10 and SWI4 gene products." EMBO Journal. 11. 4923-4932 (1992)
[文献書誌] Tamura K,Kanaoka Y,Jinno S,Nagata A,Ogiso Y,Shimizu K,Hayakawa T,Nojima H,& Okayama H.: "Cyclin G:a new mammalian cyclin with a potential tyrosine phosphorylation site." Oncogene.
[文献書誌] 野島博: "遺伝子診断入門" 羊土社(東京), 188 (1992)

1992 年度 実績報告書

ヒトcDNAバンクの全カタログ化をめざした新しいベクターシステムの開発と応用

研究代表者

野島 博 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (30156195)

研究成果

[文献書誌] Kizaka-Kondoh S,Sato K,Tamura K,Nojima H,& Okkayama H.: "Raf-l protein kinase is an integral component of oncogenic signal cascade shared by epidermal growth factor and platelet-derived growth factor." Molecular Cellular Biology. 12. 5078-5086 (1992)

[文献書誌] Tatsuka M,Mitui H,Wada M,Nagata A,Nojima H,& Okayama H.: "Elongation factor-alfa is a transformation-susceptibilety determinant in BALB/c 3T3 cells." Nature. 359. 333-336 (1992)

[文献書誌] Tanaka K,Okazaki K,Okazaki N,Ueda T,Sugiyama A,Nojima H,& Okayama H.: "A new cdc gene required for S phase entry of Schizosaccharomyces pombe encodes a protein similar to the cdc10 and SWI4 gene products." EMBO Journal. 11. 4923-4932 (1992)

[文献書誌] Tamura K,Kanaoka Y,Jinno S,Nagata A,Ogiso Y,Shimizu K,Hayakawa T,Nojima H,& Okayama H.: "Cyclin G:a new mammalian cyclin with a potential tyrosine phosphorylation site." Oncogene.

[文献書誌] 野島 博: "遺伝子診断入門" 羊土社(東京), 188 (1992)

1992 年度実績報告書

野島博大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (30156195)

[文献書誌] 野島博: "遺伝子診断入門" 羊土社(東京), 188 (1992)