光微分照射ディ-プ・エッチングのための高性能真空蒸着装置の試作と応用

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02559005
• 研究機関: 山形大学
• 研究代表者: 外崎 昭 山形大学, 医学部, 教授 (90004572)
• 研究分担者: 小池 数与 山形大学, 医学部, 助手 (80234657) ; 渡辺 皓 山形大学, 医学部, 助教授 (80004662) ; 八木橋 操六 弘前大学, 医学部, 講師 (40111231) ; 徳永 史生 大阪大学, 理学部, 教授 (80025452)
• キーワード: クリ-ン真空蒸着装置 / 凍結レプリカ法 / ディ-プ・エッチング・レプリカ法 / 集束光による表面昇華 / 生体膜

研究概要

試作装置の性能評価:当初計画より遅れて、平成3年1月に装置が完成、日本電子昭島工場にて性能チェック後、2月に納入された。このため試作装置を用いた実験に十分な時間を充てることができなかったが、その後の実験から以下の改良点が確認された。1.光照射を装置正面のガラス壁を通して行なうよう設計されたため、ズ-ム実体鏡下で微調整された単色光束を正確に試料割断面に照射可能となった。2.現在使用の白色光束エネルギ-で照射した場合、試料温度‐120℃、1時間照射で浅いエッチング像が得られ、‐110℃、45分照射で十分なエッチング効果が認められた。従って、生物試料に応じてエッチング量の調節が可能となった。3.クリ-ン・高真空(10^<‐6>Pa)でレプリカ作製の一連の操作が行なわれるため、コンタミネ-ションの少ない高解像レプリカが得やすくなった。4.試料下部を加熱する従来の方法と異なり、光微分照射法では観察表面を選択的に加熱するため、無益な気化分子が産生されず、従来の方法に較べ像障害の少ない高解像レプリカが得られやすい。
応用研究の結果:網膜光受容膜に対する免疫抗体や、標識レクチンの結合性をエッチング法により観察し、視物質や外節膜表面の糖鎖の性質と分布を確かめた。また、各種のシナプス受容膜の表面構造についても、エッチング法により観察し、各シナプスにおける構造特異性を明らかにした。これらの結果をもとに、本研究補助金で購入された3次元画像解析装置を用いて定量的検討がなされ、その結果の詳細を、本研究報告書(冊子体)の応用研究1、2に示した。
今後は、期間内に行なえなかった試料についての所見を追加し、新しい生体物性研究の先導的試行を目指したい。

研究成果

• [文献書誌] Toshihiko Kikuchi: "Microtubule subunits of guinea pig vestibular epithelial cells." Acta Otolaryngol.(Stockh),Suppl.481. 107-111 (1991)
• [文献書誌] Hiroshi Washioka: "Horizontal-cell gap junction in the goldfish retina:Area and density of particles as revealed by complementary freeze replicas." Arch.Histol.Cytol.54. 181-188 (1991)
• [文献書誌] Hiroshi Watanabe: "Nicotinic and muscarinic postsynaptic membranes:Ultrathin-section and freeze-fracture studies." J.Autonom.Nerv.Sys.33. 144-145 (1991)
• [文献書誌] Mika Yoshida: "Anti-lamprey retinal antibodies:Immunohistochemistry on the retinas of several species of vertebrates." Cell Tiss.Res.266. 419-426 (1991)
• [文献書誌] Hiroshi Watanabe: "Intramembrane particles in the postsynaptic membranes of the S-,F-,and C-type synapses by freeze-fracturing and deep-etching studies on the Xenopus spinal cord." Adv.Exp.Med.Biol.287. 349-354 (1991)
• [文献書誌] Makoto Ishikawa: "Photoreceptor-cell membranes of Lampetra japonica:Binding ratios of concanavalin A,peanut agglutinin,and anti-rhodopsin antibody by electron microscopy." (1992)
• [文献書誌] 渡辺 皓: "ニュ-ロサイエンス講座、第2巻「新しい神経伝達研究法・I」電子顕微鏡" 工藤 佳久、佐藤 公道(編者)、広川書店, (1992)
• [文献書誌] 渡辺 皓: "「電子顕微鏡チャ-トマニュアル」レプリカ法:解説" 二重作 豊、安達 公一、朝倉 健太郎(編者)、医学出版センタ-, (1992)