蛋白質プライミングDNAポリメラ-ゼのプライミング機能領域

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02640497
• 研究機関: 上智大学
• 研究代表者: 松本 幸次 上智大学, 理工学部, 講師 (00119140)
• キーワード: DNAポリメラ-ゼ / 蛋白質プライミング / アフィディコリン耐性突然変異 / dNTP結合領域 / DNA複製 / ファ-ジφ29とM2

研究概要

φ29DNAポリメラ-ゼ(pol)遺伝子の発現プロモ-タ-下流へのクロ-ニングとpolの精製:ファ-ジM2ではpolをtacプロモ-タ-下流にクロ-ニングし、polを大量精製することに既に成功している。本研究はφ29pol遺伝子をT7φ10プロモ-タ-下流に連結しpolの大量精製を実現した。20lの大腸菌培養から約20mgの精製φ29polを得た。精製標品はX線結晶回折による三次元構造解析のためD.Ollis教授(米国North western大)に送付した。
dNTP認識領域:アフィディコリン耐性突然変異株15株を新らたに分離した。これらはアフィディコリンに対する耐性の度合から4つの群に分類された。いづれの耐性株もホスホノ酢酸、araC、araA等のヌクレオシド類似体に対する感受性が変化しdNTP認識領域とアフィディコリン認識領域の重複が明らかとなった。既に3株の突然変異座を決定。
蛋白質プライミング機能領域:T7φ10プロモ-タ-下流に連結したφ29、M7の両Pol遺伝子にCOOH末端側から欠失を導入した実然異株を作成。精製した欠失型Pol(20〜100アミノ酸を欠失)は、いづれもプライマ-蛋白質と結合できないことがグリセロ-ル密度勾配遠心による分析により明らかになった。これら欠失型polは蛋白質プライミング活性を欠いており、C末端側にあるプライマ-蛋白質結合領域が、蛋白質プライミング機能に必須の領域であることが示された。
φ29polの転写後発現抑制:φ29pol遺伝子は大量発現系として安定なクロ-ンの入手が困難であった。同一転写単位上でpol遺伝子の下流にある遺伝子1を欠失させることにより、polの大量発現が可能となることを見出し、polの発現は転写後の過程で遺伝子1産物により抑制されることを明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] K.MATSUMOTO,CH.I.KIM H.KOBAYASHI,H.KANEHIRO H.HIROKAWA: "Aphidicolinーresistant DNA polymerase of bacteriophage φ29 APH^r71 mutant is hypersensitive to phosphonoacetic acid and butyl phenyldeoxyguanosine 5'ーtriphosphate" Virology. 178. 337-339 (1990)
• [文献書誌] H.KOBAYASHI,K.KITABAYASHI,K.MATSUMOTO,H.HIROKAWA: "Primer protein of bacteriophage M2 exposes the RGD receptor site upon linking the fierst deoxynucleotide" MOL.GEN.Genet.
• [文献書誌] H.KOBAYASHI,K.KITABAYASHI,K.MATSUMOTO,H.: "RGD receptor sequence in the terminal protein of bacteriophage M2" Virology.
• [文献書誌] K.MATSUMOTO,A.TAKEUCHI,H.HIROKAWA: "Region for proteinーpriming function of φ29 and M2 DNA polymerases"
• [文献書誌] M.NOMURA,K.MATSUMOTO,H.HIROKAWA: "Aphidicolinーresistant mutants of bacteriophage φ29:Analyses with phosphonoacetic acid and arabinosyl analogs."
• [文献書誌] A.TAKEUCHI,K.MATSUMOTO H.HIROKAWA: "Cloning and regulation of expression of ф29 and M2 DNA polymerase genes"