| 研究課題/領域番号 |
02650711
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
山根 恒夫 名古屋大学, 農学部, 教授 (70026102)
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| 研究分担者 |
堀越 弘毅 東京工業大学, 工学部, 教授 (80087551)
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| キーワード | 分秘ベクタ- / 大腸菌 / βーペニシリナ-ゼ / 自動流加培養法 / 濁度センサ- / 遺伝子組換え菌 / tacプモロ-タ- / Kil遺伝子 |
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| 研究概要 |
(1)分秘ベクタ-保有大腸菌の流加培養(分担研究者:山根恒夫)
昨年に引き続き、プラスミドpEAP82ー1に好アルカリ性Bacillus spのペリシリナ-ゼ遺伝子を組み込んだ場合について研究した。とくに、初発培地としてトリプトンと酵母エキスを用い、培養初期にグリセロ-ルを流加し、溶菌を極力抑え、菌体濃度を20g/l程度まで高め、後半でトリプトンと酵母エキスとグリセロ-ルの3成分を種々の流量で供給するという2段階の自動流加法について詳細に調べた。その結果、2段階流加培養の培養後半でのグリセロ-ルの流加は、菌体外の酵素活性を高める上で有効であること、また流加量を多くすると、菌体濃度は高くなるが、酵母活性は高くならないこと、分秘率は実験を行ったグリセロ-ル流加の範囲ではあまり差がないことがわかった。菌体当りの菌体外酵素活性から考えると、2段階流加培養の培養後半でグリセロ-ルの流加の最適な比基質供給速度、qsf[(gーsubstrate)・(gーdry cell weight)^<-1>・h^<-1>]は0.10であると考えられる。この条件での成績は、LB培地を用いた回分培養の成績と比較して、菌体外の最大酵素活性は約20倍まで上がり、生産性[Unit・L^<-1>・h^<-1>]は約5倍となった。
(2)分秘ベクタ-の改造(分担者:堀越弘毅)
菌体外分秘ベクタ-の分秘発現の強化を目指してペニシリナ-ゼプロモ-タ-とtacプロモ-タ-を持った分秘ベクタ-pEAP85を構築した。更に好アルカリ性バチルス38ー2由来のサイクロデキストリン合成酵素(CGTase)遺伝子をこの分秘ベクタ-pEAP85や大腸菌ー枯草菌のシャトルベクタ-に導入してその分秘発現におよぼす影響を調べた。その結果、pEAP85ーCGTを持つ大腸菌においてCGTaseは高発現し、しかも大部分の活性が菌体外に分秘されることがわかった。
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