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1.分秘ベクタ-保有大腸菌の流加培養(分担研究者:山根恒夫)
分秘ベクタ-保有大腸菌による好アルカリ性菌由来のペニシリナ-ゼの分秘生産に及ぼす培地組成および培養条件の影響を調べた。グルコ-スと無機塩とからなる合成培地では、ほとんど分秘されないが、LB培地ではよく分秘され、さらにLB培地に種々の炭素源を加えた場合、グリセロ-ルが好成績を与えた。次に、初発培地としてLB培地を用い、かつ培養初期にグリセロ-ルを流加し、溶菌を極力抑え、菌体濃度を20g/L程度まで高め、後半でLBとグリセロ-ルの3成分を種々の流量で供給するという2段階の自動流加法について詳細に調べた。自動流加の方策は、濁度センサ-で菌体濃度を連続的に測定し、これと培養液量とから総菌量を算出し、比グリセロ-ル供給速度qsf[g・(gDC)^<ー1>・h^<ー1>]を種々変える方式である。実験結果から、培養後半のグリセロ-ルの流加は、菌体外酵素活性を高めるのに有効であること、また流加量を多くすると菌体濃度は高くなるが酵素活性は高くならないこと、分秘率は85ー90%であること、などがわかった。培養後半のグリセロ-ルの流加の最適値はqsf=0.10であることがわかった。この条件での成績は、LB培地を用いた回分培養の成績と比較して、菌体外の最大酵素活性は約20倍まで上がり、生産性[Unit・L^<ー1>・h^<ー1>]は約5倍となった。
2.分秘ベクタ-の改良(分担者:堀越弘毅)
菌体外分秘ベクタ-の分秘発現の強化を目指して、ペニシリナ-ゼプロモ-タ-とtacプロモ-タ-を持つ分秘ベクタ-pEAP85を構築した。このベクタ-に好アルカリ性バチルス菌由来のサイクロデキストリン合成酵素(GTase)遺伝子を導入して、その分秘発現におよぼす影響を調べた。その結果、pEAP85ーCGTを持つ大腸菌においてCGTaseは高発現し、しかも大部分の活性は菌体外に分秘されることがわかった。
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