ATP依存性輸送膜蛋白質の機能の解明

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02660091
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 植田 和光 京都大学, 農学部, 助手 (10151789)
• 研究分担者: 駒野 徹 京都大学, 農学部, 教授 (30026413)
• キーワード: 膜輸送蛋白質 / Pー糖蛋白質 / 襄胞性繊維症 / ATPase / リン脂質 / 融合蛋白質 / 酵母 / 培養細胞

研究概要

真核生物のATP依存性輸送膜蛋白質は、ATP加水分解のエネルギ-に依存して、イオン、ホルモン、薬剤などを細胞外に排出するポンプであり、細胞分化、癌の多剤耐性、遺伝病など生命の重要な局面で機能している。本研究は、申請者らの単離したPー糖蛋白質をモデルに用い、これまで困難であった簡便な精製法を確立し、個々のドメインの活性を測定できる実験系を確立し、遺伝子工学的に作成した種々の変異体の活性を測定することによって、ATP依存性輸送膜蛋白質の作用機作を解明することを目的とした。
Pー糖蛋白質は2つのATP結合領域を持ち、薬剤輸送には両方の領域が必要であることが報告されてあるが、ATPのエネルギ-が薬剤運搬にどのように使われているのかは不明である。そこで種々の変異を導入したPー糖蛋白質とβーガラクトシダ-ゼ(βーgal)の融合蛋白質を酵母中で発現させ、抗βーgal抗体を用いて部分精製し、ATPase活性を測定した。Pー糖蛋白質のATPase活性はリン脂質の存在が必要であり、後半半分だけでは活性は示さなかった。さらに細胞を耐性にする活性とATPaseの連関を検討するためNIH3T3細胞で発現させた。βーgal融合Pー糖蛋白質は細胞を多剤耐性にした。同様に部分精製したPー糖蛋白質は、50ー200nmol/mg/minのATPase活性を示した。現在襄胞性繊維症の原因であるCFTR遺伝子に見つかっている種々のアミノ酸置換を導入したPー糖蛋白質をNIH3T3中で発現させている。これらの変異蛋白の活性を測定することによって、作用機性がより明らかになると思われる。

研究成果

• [文献書誌] ShiMabuku,A.M.: "Production of a site specifically cleavable PーglycoproteinーβーGalactosidase fusion protein" Agric.Biol.Chem.55. 1075-1080 (1991)
• [文献書誌] Tanaka S.: "Use of recombinant Pーglycoprotein fragments to produce antibodies to the multidrug transporter" Biochem.Biophys.Res.Commun.166. 180-186 (1990)
• [文献書誌] Sugawara,I.: "In situ localization of the human multidrugーresistance gene mRNA using thymineーthymine dimerized singleーstranded cDNA" Jpn.J.Cancer Res.81. 949-955 (1990)
• [文献書誌] Chen,Cーj.: "Genomic organization of the human multidrug resistance MDRl gene and origin of Pーglycoproteins" J.Biol.Chem.265. 506-514 (1990)
• [文献書誌] Goldstein,L.J.: "Expression of the multidrug resistance,MDRl,gene in neuroblastomas" J.Clin.Oncol.8. 128-136 (1990)
• [文献書誌] McLachlin,J.R.: "Expression of a human complementary DNA or the multidrug resistance gene in murine hematopoietic precursor cells with the use of retroviral gene transfer" J.Natl.Cancer Inst.82. 1260-1263 (1990)