| 研究概要 |
1.ベクタ-の開発:1)プロモ-タ-の検討;大腸菌用のプロモ-タ-検索ベクタ-(pMC1403)を用いてT.ferrooxidans AP19ー3株の染色体DNAよりプロモ-タ-遺伝子の検索を行い、29株のプロ-タ-挿入株を得た。その中、pTEP12,15,19,26,28の各挿入断片の塩基配列の決定を行った。その結果、大腸菌のプロモ-タ-に特有な配列(TTGACAー17塩基対ーTATAAT)と相同性の高い配列が認められ、T.ferrooxidansのプロモ-タ-の一部は大腸菌RNAポリメラ-ゼにより認識、結合されることを明らかにした。2)マ-カ-遺伝子の検討;大腸菌ーThiobaーcillus属細菌間のシャトルプラスミドベクタ-の構築には、宿主中での発現を確認しうる遺伝子が必要である。そこで、大腸菌、酵母などでマ-カ-遺伝子として利用されているロイシン生合成系に関与する3ーイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素遺伝子(leuB)のクロ-ニングを行った。遺伝子の全塩基配列を決定した結果、推定されたアミノ酸配列はこれまでに明かにされている大腸菌、酵母、好熱性細菌、好アルカリ性細菌のものと高い相同性が見られた。今後、leuB遺伝子中にトランスポゾンを利用して抗生物質耐性マ-カ-を挿入した変異株を取得することにより、本遺伝子のマ-カ-遺伝子としての利用に期待がもたれる。
2.薬剤感受性株の調製:アンピシリン耐性遺伝子をマ-カ-として形質転換を行う場合の宿主を調製するため、T.ferrooxidans AP19ー3株の低濃度アンピシリン感受性株の調製を試みた。その結果、25ug/mlのアンピシリンに感受性の変異株を4株取得した。
3.形質転換法の検討:作製したシャトルプラスミドベクタ-のThiobacillus属細菌への導入について検討した。Thiobacillus属細菌は強固な膜構造のため、従来大腸菌などで用いられている塩化カルシウムによる処理やアルカリ金属法ではプラスミドの導入は困難であった。そこで、動物細胞などにおいて利用されているエレクトロポレ-ション法について検討した。パルス3回のときに致死率30〜70%という値が得られた。現在、使用緩衝液などについて検討を行っている。
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