| 研究概要 |
1)担子菌のミトコンドリアDNAの抽出と精製。菌体をミラクロスで濾過し減菌水およびSGBで洗浄する。次に3倍量のSGBを加えポリトロンでホモゲナイズして、カ-ゼ、ミラクロスで濾過、濾液を2500×gで20分間遠心する。上澄を20000×g、30分遠心して沈澱物をSGBで20000×gで洗浄。沈澱物を10mlのSGBに懸濁し、IM.MgCl_2、100μlとDNase0.5mgを加え撹拌し氷上で1時間反応させる。その後GMを加え20000×gで30分遠心.沈澱物を5mlGMで懸濁し、テフロンホモジナイザ-で処理後、B4バッファ-10mlに重層し13500×g10分遠心する。下層バンドをピペットで集めGMで懸濁遠心し、精製ミトコンドリアを得た。これにザルコシル、プロティナ-ゼKを加え37℃2時間処理、クロロホルム: フェノ-ル(1: 1)を加え、除タンパクを行う。その後エタノ-ル沈澱を行い最終精製作を得た。
これらの試料は現在制限酵素処理して電気泳動を行い分析中である。
2)染色体のパルスフィ-ルドによる分離
醤油、玉葱培地で培養した菌体をセルラ-ゼ2%、ウスキザイム1%,キチナ-ゼ0.1%,0.5Mマニト-ルをいれたリンゴ酸緩衝液(pH5.6)で30℃3時間処理しプロトプラストを調製した。収量は6×10^8ml。寒天ゲル濃度0.6%、RNaseの前処理は1mg/ml、50mM Tri塩酸pH7.5 95℃10分処理、本処理はTE中で1/100容量の試料を入れ37℃で1時間処理した。パルス時間を20ー22.5分で3本のバンドが得られた。現在より明確なバンドを得るために実験を行っている。
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