ス-パ-オキシドディスムタ-ゼmRNA発現細胞の観察ーIn situ hybrization法による同定と解析

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02670011
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 佐々木 順造 岡山大学, 医学部, 助教授 (30093686)
• キーワード: In situハイブリダイゼ-ション / SOD / アクチン / ジゴキシゲニン / RNAプロ-ブ

研究概要

従来より酸素分子が新生児網膜症のような重篤な障害を起こすことはよく知られていましたが、近年、活性酸素分子種が虚血性疾患の発生に重要な役割を演じていることが示唆されてきました。このような活性酸素を防御する機構の一つにス-パ-オキシドディスムタ-ゼ(SOD)があります。著者は主としてラットを用いて正常組織におけるSODの発現をIn situハイブリダイゼ-ション(ISH)法により観察しました。ヒトSODのcDNAより ^<35>SーUTPを組み込んだRNAブロ-ブを作成し実験に供しました。その結果、脳虚血の際著明な変化を示すことが知られている海馬領域をはじめ小脳のプルキンエ細胞、肺気管支上皮などに発現が観察されました。また好酸球に強い発現が認められ、この細胞の機能の考察に重要な手がかりが得られました。
ISH法には、従来より放射性標識プロ-ブを用いた方法と、非放射性標識プロ-ブを用いた方法があります。放射性標識プロ-ブを用いた方法は、シグナルの検出感度が高い優れた方法ですが、いくつかの欠点があります。フィルタ-ハイブリダイゼション等に用いられる非放射性標識RNAプロ-ブ作成のためのキットが発売されたのを機会にIn situハイブリダイゼ-ションへ応用を試みました。digoxigeninーUTPの存在下RNAプロ-ブを作成し、ハイブリダイゼ-ションを行った後、抗digoxigeninーアルカリフォスタ-ゼ複合体を結合させ、アルカリフォスファタ-ゼ反応により検出する方法です。アクチンのmRNAの発現の検出を目安にしたところ、光学顕微鏡レベルのみならず、一部、電子顕微鏡レベルにおいてもシグナルを検出でき、SODのmRNA発現についてもパ-コ-ルにより分離した好酸球に弱いながらもシグナルを検出できました。

研究成果

• [文献書誌] JUNZO SASAKI: "SYNTHESIS OF ACTIN IN THE NONCILIATED BRONCHIOLAR EPITHELIAL(CLARA)CELLS OF PERINATAL RATS DEMONSTRATED BY ELECTRON MICROSCORY AND IN SITU HYBRIDIZATION^*" Acta Histochem.Cytochem.23. 453-465 (1990)
• [文献書誌] Masayasu Inoue: "Inhibition of oxygen toxicity by targeting superoxide dismutase to endothelial cell surface" FEBS LETTER. 269. 89-92 (1990)
• [文献書誌] SADAHIRO WATANABE: "IMMUNOFLUORESCENCE MICROSCOPIC STUDY ON THE CYTOSKELETAL FILAMENTS IN THE SEPARATED SUPERFICIAL CELLS OF RAT URINARY BLADDER EPITHELIUM" Acta Histochem.Cytochem.24. 21-27 (1991)
• [文献書誌] Junzo SASAKI: "The Expression of Actin mRNA in Megakaryocytes Demonstrated in Paraffin Sections,and Epoxy Resin SemiーThin and Thin Sections by In Situ Hybridization." J.Electron Miuroscopy. 40. (1991)
• [文献書誌] JUNZO SASAKI: "THE LOCALIZATION OF ACTIN mRNA IN MEGAKARYOCYTES DEMONSTRATED BY IN SITU HYBRIDIZATION USING DIGOXIGENINーLABELED RIBOPROBES." Acta.Histochem.Cytochem.24. (1991)
• [文献書誌] 佐々木 順造: "放射性および非放射性標識リボプロ-ブによるIn situハイブリダイゼ-ション法" 岡山医学会雑誌. 103. (1991)
• [文献書誌] Eisuke Sato: "OVEREXPRESSION IN YEAST OF NEUTROPHLL SPECIFIC RECOMBINANT 39kDa PROTEIN,ANNEXIN I,AND ITS BIOCHEMICAL PROPERTIES in Novel CalciumーBinding Proteins." Springer, (1991)
• [文献書誌] Masayasu Inoue: "INHIBITION OF OXYGEN TOXICITY BY REGULATING ACTIVE OXYGEN METABOLISM IN AND AROUND VASCULAR ENDOTHELIAL CELLS WITH SITEーDIRECTED SOD DERIVATIVES in Oxidative Damage and Repair" Pergamon Press, (1991)