培養細胞を用いてのγGTPの細胞内発現とその役割の解明

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02670018
• 研究機関: 慶応義塾大学
• 研究代表者: 塩沢 昌英 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (50170840)
• 研究分担者: 安田 健次郎 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (90050327) ; 山下 修二 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (90050666)
• キーワード: γGTP / ノザン・ハイブリダイゼ-ション / モノクロ-ナル抗体 / トランスフォ-マント

研究概要

γーglutamyl transpeptidase(γGTP)は癌胎児性蛋白の一つであり、解毒、アンモニア生成、ロイコトリエン生成等に関与するといわれる。しかしながら、これらの機能の証明はin vitroの系を用いて得られたものであり、実際の生体内におけるγGTPの役割は未だに明らかとなっていない。そこで我々は近位尿細管由来の細胞株であるCVーlやCos cellにヒトγGTPcDNAの遺伝子導入を行い、ヒトγGTPを発現する細胞株を作成し、in situ hybridization、ノザン・ハイブリダイゼ-ションおよび我々が作成したヒトγGTPに対するモノクロ-ナル抗体を用いて、mRNAレベルおよび蛋白レベルでのrGTPの発現を明らかにし、細胞株の変化を形態学的および生化学的にとらえてγGTPの機能を解明する。
ヒトγGTPcDNAをSV40のプロモ-タ-、エンハンサ-およびネオマイシン耐性遺伝子を有するベクタ-に組込み、サルの近位尿細管由来の細胞株であるCVーlおよびCos cellにリン酸カルシウム法を用いて遺伝子導入を行い、G418selectionにより、5クロ-ンのトランスフォ-マントを得た。γGTPの発現はノザン・ハイブリダイゼ-ションにより検出することができたが、その発現はtransientなものであり、stableにγGTPを発現するクロ-ンは得られなかった。
今後は、γGTPをstableに発現するクロ-ンを得て、そのクロ-ンの生化学的および形態学的性状を明らかにして、γGTPの機能解明を試る予定である。

研究成果

• [文献書誌] Shiozawa,M.,Hiraoka,Y.,Yasudo,K,Imamura,T.,Sakamuro,D.,Taniguchi,N.,Yamazoe,M.,& Yoshikawa,H.: "Synthesis of human gammaーglutamyl transpeptidese during the tetal development of liver." Gene. 87. 299-303 (1990)
• [文献書誌] 山下 修二,塩沢 昌英,安田 健次郎: "急速凍結置換固定法ー免疫電顕への応用" 組織細胞化学. 25-34 (1990)
• [文献書誌] Yasuda,K.,Shiozawa,M.,Yamashita,S.& Aiso,S.: "Localization of γーglutamyl transpeptidase in human sweat glands:An immunohistochemical study using a monoclonal antibody." J.Histochem.Cytochem.38. 1433-1444 (1990)
• [文献書誌] Yasuda,K.,Yamashita,S.,Aiso,S.& Shizawa,M.: "Microwave fixation:Examination of temperature in tissue during irradiation." Acta histochem.cytochem.23. 537-551 (1990)
• [文献書誌] Hiraoka,Y.,Tatsumi,K,Shiozawa,M.,Aiso,S.,FuKasawa,T.Yasuda,K.& Miyai,K.: "A placentaーspecific 5^' nonーcoding exon of human prolaction." Mol.Cell.Endocrinol.75. 71-80 (1991)