アラキドン酸12ーリポキシゲナ-ゼの遺伝子クロ-ニングとその発現

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02670110
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 吉本 谷博 徳島大学, 医学部, 助教授 (60127876)
• キーワード: アラキドン酸 / 12ーリポキシゲナ-ゼ / 遺伝子 / クロ-ニング / 一次構造

研究概要

アラキドン酸12ーリポキシゲナ-ゼをブタ白血球の可溶性面分から、モノクロ-ン抗体を用いた免疫親和性クロマトで均一にまで精製した。精製酵素標品をAchromobacter proteinase I(リジルエンドペプチダ-ゼ)で消化した後、ペプチド断片を逆相高速液クロで分取し、約150個のアミノ酸配列を決定した。同時に酵素のN末端アミノ酸配列(31個)を明らかにした。この酵素の部分アミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチドを化学合成した。酵素含量の最も高いブタ白血球から、チオシアン酸グアニジウムー塩化セシウム遠心法によって全RNAを抽出し、オリゴ(dT)セルロ-スによってpoly(A)^+RNAを精製した。このpoly(A)^+RNAからオリゴ(dT)をプライマ-として、cDNAライブラリ-を作製した。このcDNAライブラリ-を、先の酵素の部分アミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチドを ^<32>Pで標識したものをプロ-ブとしてスクリ-ニングした結果、酵素の全翻訳領域を含むcDNAクロ-ニングが得られた。得られたcDNAの塩基配列より推定される酵素の一次構造によると、酵素は662個のアミノ酸残基より成り、その分子量は74,911と計算された。酵素蛋白の中央部分(アミノ酸残基293ー298と374ー383)に比較的疎水性の部分が認められたが、全体としては親水性の蛋白質であり、このことは酵素が白血球の細胞質に局在するという免疫組織化学的知見ともよく一致している。この酵素のアミノ酸配列を他のリポキシゲナ-ゼと比較したところ、ヒト網状赤血球の15ーリポキシゲナ-ゼと86%、ヒト白血球の5ーリポキシゲナ-ゼとは41%の相同性が認められ、分子進化論的に12ーリポキシゲナ-ゼは5ーリポキシゲナ-ゼよりも15ーリポキシゲナ-ゼに近いことが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Ueda,N.: "Localization of arachidonate 12ーlipoxygenase in parenchymal cells of porcine pituitary" J.Biol.Chem.265. 2311-2316 (1990)
• [文献書誌] Yoshimoto,T.: "Cloning and sequence analysis of the cDNA for arachidonate 12ーlipoxygenase of porcine leukocytes" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 87. 2142-2146 (1990)
• [文献書誌] Yoshimoto,T.: "Molecular cloning and expression of human arachidonate 12ーlipoxygenase" Biochem.Biophys.Res.Commun.172. 1230-1235 (1990)
• [文献書誌] Yoshimoto,T.: "Prostaglandins and Related Compounds,Vol 21,pp.29ー32" Raven Press, 4 (1990)
• [文献書誌] Yoshimoto,T.: "Lipoxygenase in Inflammation,pp.88ー103" Academic Press, 16 (1991)