アラキドン酸12ーリポキシゲナ-ゼの遺伝子クロ-ニングとその発現

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02670110
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 吉本 谷博 徳島大学, 医学部, 助教授 (60127876)
• キーワード: Leukocyte / Arachidonic acid / 12ーLipoxygenase / cDNA / Cloning / Expression / Northern blotting

研究概要

ブタの白血球のアラキドン酸12ーリポキシゲナ-ゼを、モノクロ-ン抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィ-によって精製した。精製酵素をリジルエンドペプチダ-ゼで消化した後に、生じたペプチド断片およびN末端のアミノ酸配列を、気相ペプチドシ-クエンサ-で決定した。このペプチドの部分アミノ酸配列に基づいて2本のオリゴヌクレオチドを合成し、これをプロ-ブとしてブタ白血球のcDNAライブラリ-から酵素のcDNAをクロ-ニングした。酵素のcDNAの翻訳領域は663個のアミノ酸をコ-ドしており、分子量は74,911と計算された。ブタの各組織から抽出したRNAをアガロ-ス電気泳動で分離した後に、12ーリポシゲ ナ-ゼのcDNAをプロ-ブとして、ノ-ザンブロティングを行なった。酵素のmRNAは白血球に最も多く、その他に下垂体、肺、小腸や脾臓にも認められ、酵素が生体内に広く分布していることが示された。
この12ーリポキシゲナ-ゼのcDNAを大腸菌で発現するために、cDNAをtacプロモ-タをもつpkkプラスミドに組み込み、発現ベクタ-を構築した。この発現ベクタ-で大腸菌を形質転換し、イソプロピルチオーβーDーガラクトシドで酵素タンパクを発現誘導した。この大腸菌の抽出物をアラキドン酸と反応させ、反応産物を高速液体クロマトグラフィ-で分析すると、12ーヒドロキシ酸と同定され、大腸菌で発現された蛋白が12ーリポキシゲナ-ゼ活性をもつことが示された。さらに、酵素に対する抗体を用いたウェスタンブロティングによって大腸菌の抽出物で陽性バンドが認められ、大腸菌で酵素蛋白が発現していることが確認された。

研究成果

• [文献書誌] Yodhimoto,T.: "Molecular cloning and expression of human arachidonate 12ーlipoxygenase" Biochem.Biophys.Res.Commun.172. 1230-1235 (1990)
• [文献書誌] Yoshimoto,T.: "Cloning and sequence analysis of the cDNA for arachidonate 12ーlipoxygenase of porcine leukocytes" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 87. 2142-2146 (1990)
• [文献書誌] Ueda,N.: "Localization of arachidonate 12ーlipoxygease in parenchymal cells of porcine pituitary" J.Biol.Chem.265. 2311-2316 (1990)
• [文献書誌] Kroneck,P.M.H.: "Porcine leukocyte 5ーand 12ーlipoxygenases are iron enzymes" FEBS Lett.287. 105-107 (1991)
• [文献書誌] Matsuda,S.: "Analysis of nonーheme iron in avachidonate 12ーlipoxygenase of porcine leukocytes" Biochim.Biophys.Acta. 1084. 202-204 (1991)
• [文献書誌] Oshima,T.: "cAMPーdependent induction of fatty acid cyclooxygenase mRNA in mouse osteoblastic cells(MC3T3ーE1)" J.Biol.Chem.266. 13621-13626 (1991)
• [文献書誌] Yoshimoto,T.: "Advances in Prostaglandin,Thromboxane,and Leukotrine Research" Reven Press, 29-32 (1990)
• [文献書誌] Yoshimoto,T.: "Lipoxygenase and Their Products" Academic Press, 89-104 (1991)