細胞内輸送経路における蛋白質の特異的修飾機構

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 02670117
• 研究機関: 福岡大学
• 研究代表者: 池原 征夫 福岡大学, 医学部, 教授 (70037612)
• 研究分担者: 大久保 久美子 福岡大学, 医学部, 助手 (80223759) ; 高見 昇 福岡大学, 医学部, 助手 (80154904) ; 三角 佳生 福岡大学, 医学部, 助手 (10148877)
• キーワード: プロ型前駆体変換酵素 / Furin / cDNAクロ-ニング / 変換酵素インヒビタ- / プロアルブミン / 補体C3前駆体

研究概要

I.プロ型前駆体変換酵素遺伝子のクロ-ニングと一次構造の解析.
1)ヒトおよびラット肝cDNAライブラリ-からそれぞれ4.7kbおよび4.3kbのFurinに対するcDNAクロ-ンを得た。塩基配列から推定されるFurinの一次構造は,ヒトで794残基,ラットで793残基のアミノ酸から構成されており,N末端側に約300残基のズブチリシン類似の構造およびC末端近くに膜貫通部位に相当する配列をもつことがわかった。ヒトとラットの間には93.7%の相同性がみられた。
2)アルブミンおよび補体C3のcDNAをトランスフェクトしたCOSー1細胞では,合成された各プロ型前駆体の約50%はプロセスされずに分泌された。これにFurinを発現させると,各プロ型前駆体は完全にプロセスされることがわかった。本研究で得たFurinはプロ型前駆体変換活性をもつエンドプロテア-ゼであると結論される。
II.プロ型前駆体変換酵素に対する特異的インヒビタ-の調製と応用。
1)ラット肝cDNAライブラリ-からα_1ープロテア-ゼインヒビタ-(α_1ーPI)およびコントラプシンのcDNAクロ-ンを得た。部位特異的変異手法により,α_1ーPIの352番目のMetをArgに,またコントラプシンの359番目のLysをArg変えて,プロテア-ゼとの反応部位にArgーSerをもつ変異体をコ-ドするcDNAを調製した。
2)COSー1細胞におけるトランフェクション実験の結果,発現された各変異型インヒビタ-はプロアルブミンおよびプロC3のプロセシングを完全に阻害することがわかった。正常のα_1ーPIやコントラプシンおよび反応部位に同じArgーSerをもつアンチトロンビンIIIにはこの阻害活性が認められないことから,本研究で得た変異型インヒビタ-はプロ型前駆体変換酵素に特異的なインヒビタ-として利用できることがわかった。

研究成果

• [文献書誌] Misumi,Yoshio: "Molecular cloning and sequencing of the cDNA of rat liver α_1ーprotease inhibitor and its expression in COSー1 cells" Journal of Biochemistry. 108. 230-234 (1990)
• [文献書誌] Misumi,Yoshio: "Nucleotide and deduced amino acid sequence of rat complement C3" Nucleic Acids Research. 18. 2178 (1990)
• [文献書誌] Oda,Kimimitsu: "Production of propeptideーdirected antibody:Its application to the purification of proalbumin and analysis of proalbumin processing" Journal of Biochemistry. 108. 549-553 (1990)
• [文献書誌] Misumi,Yoshio: "Intracellular processing of complement proーC3 and proalbumin is inhibited by rat α_1ーprotease inhibitor variant(Met^<352>→Arg)in transfected cells" Biochemical and Biophysical Research Communication. 171. 236-242 (1990)
• [文献書誌] Misumi,Yoshio: "Sequence of the cDNA encoding rat furin,a possible propeptideーprocessing endoprotease" Nucleic Acids Research. 18. 6719 (1990)
• [文献書誌] Ohkubo,Kumiko: "Molecular cloning and characterization of rat contrapsinーlike protease inhibitor and related proteins" Journal of Biochemistry. 109. 243-250 (1991)
• [文献書誌] Misumi,Yoshio: "Primary structure of rat liver 5'ーnucleotidase deduced from the cDNA:Presence of the COOHーterminal hydrophobic domain for possible posttranslational modification by glycophospholipid" Journal of Biological Chemistry. 265. 2178-2183 (1990)
• [文献書誌] Misumi,Yoshio: "Primary structure of human placental 5'ーnucleotidase and identification of the glycolipid anchor in the mature form" European Journal of Biochemistry. 191. 563-569 (1990)
• [文献書誌] Ogata,Shigenori: "Membraneーanchoring domain of rat liver 5'ーnucleotidase:Identification of the COOHーterminal serineー523 covalently attached with a glycolipid" Biochemistry. 29. 7923-7927 (1990)
• [文献書誌] Takami,Noboru: "Intracellular accumulation and oligosaccharide processing of alkaline phosphatase under disassembly of the Golgi complex caused by brefeldin A" European Journal of Biochemistry. 194. 805-810 (1990)
• [文献書誌] Oda,Kimimitsu: "Selective processing of proalbumin determined by siteーspecific mutagenesis" Biochemical and Biophysical Research Communication. (1991)
• [文献書誌] Ohkubo,Kumiko: "Cloning,structure,and expression of mouse contrapsin and its related protein" Biochemical Journal. (1991)